細(xì)菌感染對(duì)移植肝免疫排斥反應(yīng)的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景： 感染是肝移植術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，亦是移植病人術(shù)后死亡的主要原因之一，包括病毒、細(xì)菌、真菌的感染。然而，在肝移植受者中大部分嚴(yán)重感染源自腹腔內(nèi)細(xì)菌或真菌感染，而且發(fā)生率高，約為35％-70％，半數(shù)患者感染發(fā)生在移植術(shù)后2周內(nèi)。多項(xiàng)研究已證實(shí)病毒、真菌感染與免疫排斥密切相關(guān)，促進(jìn)了排斥反應(yīng)的發(fā)生。但是細(xì)菌感染與免疫排斥反應(yīng)的關(guān)系這類(lèi)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 在臨床實(shí)際治療中，發(fā)生細(xì)菌感染的病人，免疫抑制藥物的應(yīng)用與抗感染治療產(chǎn)

2、生了矛盾，這時(shí)為搶救病人的生命，往往需要減量或停用免疫抑制藥物，而這對(duì)移植肝臟的影響我們不得而知。但現(xiàn)有的研究指出：當(dāng)發(fā)生重癥感染時(shí)，機(jī)體為保護(hù)組織器官的過(guò)度病理性損害，激發(fā)免疫反應(yīng)的同時(shí)，也可能啟動(dòng)了免疫抑制效應(yīng)。在眾多因素中，CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的表達(dá)變化引起了廣泛觀(guān)注，它能夠分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β，并通過(guò)這二種細(xì)胞因子發(fā)揮較強(qiáng)的免疫抑制效應(yīng)；而且Treg細(xì)胞能夠抑制免疫排斥反應(yīng)和移

3、植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生?；谝陨蠂?guó)內(nèi)外的研究成果，我們想到，臨床病人在肝移植術(shù)后發(fā)生細(xì)菌感染的過(guò)程中機(jī)體的免疫反應(yīng)是否被抑制?Treg細(xì)胞是否在這種變化中發(fā)生了增殖并對(duì)移植肝產(chǎn)生影響?探明這種變化必將加深對(duì)肝移植細(xì)菌感染與免疫排斥的認(rèn)識(shí)，為我們的深入研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也有助于開(kāi)展臨床新的治療策略。 目的： 一、建立大鼠肝移植腹腔細(xì)菌感染的模型，研究細(xì)菌感染對(duì)移植肝免疫排斥反應(yīng)的影響； 二、探討細(xì)菌感染和免

4、疫排斥反應(yīng)雙重因素作用下T淋巴細(xì)胞的增殖、功能的變化及Treg細(xì)胞的增殖情況和其生物學(xué)效應(yīng)。 方法、結(jié)果： 第一部分大鼠肝移植術(shù)后細(xì)菌感染對(duì)移植肝免疫排斥反應(yīng)的影響方法： 1．細(xì)菌感染模型的建立：在改良的Kamada雙袖套法的基礎(chǔ)上，以近交系DA大鼠為供體，LEW大鼠為受體，建立肝移植排斥反應(yīng)模型；以大腸桿菌為誘導(dǎo)菌，采用腹腔內(nèi)活菌注射的方法建立移植后感染模型。術(shù)后隨機(jī)分為2個(gè)注射時(shí)間點(diǎn)：術(shù)后3天和5天，并根據(jù)注

5、射細(xì)菌濃度和用量的不同，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為6組：5×10<'5>cfu/ml組，2×10<'5>cfu/ml組，2×10<'6>cfu/ml組，2×10<'7>cfu/ml組，2×10<'8>cfu/ml組和腹腔內(nèi)生理鹽水注射對(duì)照組。設(shè)菌液注射前1天，注射后1d、3d、5d、7d 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只動(dòng)物，另外設(shè)8只大鼠觀(guān)察感染后一般情況和受體的存活時(shí)間。通過(guò)對(duì)大鼠的存活時(shí)間、直腸溫度、ALT、TB、WBC計(jì)數(shù)、TCO2、HCO3<'

6、->、PH等指標(biāo)評(píng)定感染的嚴(yán)重程度。 2．感染對(duì)免疫排斥反應(yīng)的影響：以DA或LEW大鼠為供體，LEW大鼠為受體，建立肝移植感染模型，術(shù)后大鼠隨機(jī)分為4組：同基因移植對(duì)照組G1組、同基因移植腹腔感染組G2、異基因移植對(duì)照組G3、異基因移植腹腔感染組G4。腹腔內(nèi)細(xì)菌注射濃度為5×10<'5>cfu/ml。每組設(shè)感染前1d、感染后1d、3d、5d、7d 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只。通過(guò)RT-PCR測(cè)定肝內(nèi)CCR5、CCR3、MCP-1

7、mRNA，CCR5、CCR3免疫組織化學(xué)染色和肝病理Banff評(píng)分評(píng)定免疫排斥反應(yīng)。 所有數(shù)據(jù)分析均通過(guò)SAS 6.0軟件進(jìn)行，采用雙因素方差分析、t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)等方法，P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1．術(shù)后5天注射組最長(zhǎng)生存時(shí)間為感染后5天，不利于后續(xù)研究，故舍去；2或5×10<'5>cfu/ml這二個(gè)濃度在術(shù)后3天注射時(shí)，最長(zhǎng)生存時(shí)間分別為術(shù)后11天(感染后8天)、術(shù)后14天(感染后11天)，感

8、染后7天生存率分別為37.5％和100％。相應(yīng)生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2×10<'5>cfu/ml組在感染后5天相應(yīng)指標(biāo)逐漸正常，腹腔細(xì)菌培養(yǎng)陰性，故推斷腹腔感染可自行抵抗，達(dá)不到研究目標(biāo)；5×10<'5>cfu/ml組隨著病情的發(fā)展，大鼠出現(xiàn)體溫升高、酸堿平衡紊亂、WBC增加、ALT、TB持續(xù)上升等變化，與非感染組比較差異顯著；組織器官病理切片顯示，腎臟和肺臟沒(méi)有明顯的病理學(xué)改變。 2．G4組CCR5mRNA的表達(dá)逐漸下降，CCR3

9、和MCP-1mRNA的表達(dá)則逐漸升高，術(shù)后8天(感染后5天)各指標(biāo)與G2、G3組均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；肝病理Banff評(píng)分顯示，G4組肝實(shí)質(zhì)損害加重，但免疫排斥反應(yīng)減輕，與G3組比差異有顯著性(P<0.05)。 第二部分大鼠肝移植術(shù)后細(xì)菌感染對(duì)Treg、T淋巴細(xì)胞增殖、功能及分化的影響方法： 動(dòng)物分組同前：同基因移植對(duì)照組G1組、同基因移植腹腔感染組G2、異基因移植對(duì)照組G3、異基因移植腹腔感染組G4。分

10、別采用流式細(xì)胞術(shù)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)、RT-PCR技術(shù)對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群、功能、肝臟內(nèi)IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IFN-γ、TNF-α、TGF-β mRNA的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，觀(guān)察感染對(duì)T淋巴細(xì)胞功能和分化的影響。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR技術(shù)對(duì)脾臟內(nèi)Treg細(xì)胞的增殖和Foxp3mRNA的表達(dá)測(cè)定。 結(jié)果： 1．異基因移植感染組G4淋巴細(xì)胞數(shù)量持續(xù)下降，比例失調(diào)，CD4<'+>/CD8

11、<'+>比值降低，該比值在感染后各時(shí)間點(diǎn)與異基因移植組G3比較均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示：G4淋巴細(xì)胞功能持續(xù)上升，但上升速度和幅度均低于G3組，感染后3天與之比較各時(shí)間點(diǎn)均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；G2組淋巴細(xì)胞功通通雖然也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但升高不及G4組，與之比較感染前后各時(shí)間點(diǎn)均有差異； 2．肝臟內(nèi)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)測(cè)定顯示：G3組各種因子mRNA的表達(dá)均升高；G4組IL-4、IL-10、T

12、GF-β mRNA的表達(dá)水平持續(xù)增加，但三者表達(dá)水平不完全一致，后二者的表達(dá)量遠(yuǎn)高于前者；IL-2、IL-6mRNA表達(dá)水平則先升后降；G3組上述因子的mRNA表達(dá)恰恰相反，前三種下降，后二種上升，感染后5天各指標(biāo)與G3組比較均有意義，IFN-γ、TNF-α mRNA的表達(dá)則持續(xù)下降，與G2、G3組比較自感染后各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 3．G1、G2、G3組Treg細(xì)胞在術(shù)后或感染后增殖不顯著，各時(shí)間點(diǎn)及各組比較均無(wú)意義；G

13、4組Treg細(xì)胞顯著增殖，尤其是感染后5天，與其它各組及組內(nèi)比較均有差異。G4組Foxp3 mRNA的表達(dá)水平不及Treg顯著，但與G3組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第三部分 Treg細(xì)胞在移植后感染免疫紊亂中的作用方法： 以DA大鼠為供體，LEW大鼠為受體，術(shù)后分為4組：急性排斥組G1、移植后腹腔感染組G2、G3組：在第三組處理的基礎(chǔ)上于術(shù)后第2天始加用anti-IL-10和anti-TGF-β單克隆抗體，注射量分別為：1.2

14、mg/kg/d和0.9mg/kg/d，G4組：在第三組處理的基礎(chǔ)上于術(shù)后第2天開(kāi)始加用anti-CD25單克隆抗體，注射量為：1.0mg/kg/d。 每組設(shè)感染前1d、感染后1d、3d、5d、7d 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只動(dòng)物。分別采用流式細(xì)胞術(shù)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR技術(shù)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群、淋巴細(xì)胞功能、肝臟內(nèi)IL-4、IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA測(cè)定；并對(duì)肝臟內(nèi)CCR5、CCR3mRNA的表達(dá)

15、和肝臟病理Banff評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，以判定肝臟的免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果： G3、G4組T淋巴細(xì)胞數(shù)量持續(xù)下降，但CD4<'+>/CD8<'+>比值上升，G3的這種變化略顯著，感染后5天，G3組上升幅度高于G2組，二組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并在感染后5、7天與G1、G2組比較有差異；G3、G4組淋巴細(xì)胞功能得到部分恢復(fù)，與G2組比較在感染后5天有差異，與G1組比較，自感染后3天有差異。同樣地，G3組的上升幅度高于G4組，二組在感染后3天有統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)意義；G3、G4組IL-4、IFN-γ mRNA的表達(dá)顯著升高，與G2組比較，感染后即有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； G3、G4組CCR3、CCR5mRNA的表達(dá)與G2組比較均增加，感染后5天、7天與之比較各指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝臟病理Banff評(píng)分顯示，G3、G4組的免疫排斥反應(yīng)部分恢復(fù)。 結(jié)論： 1．以DA大鼠為供體，LEW大鼠為受體采用腹腔內(nèi)大腸桿菌注射的方法制作感染模型，是進(jìn)行肝移植術(shù)后細(xì)菌感染研究的理想動(dòng)物模

17、型。該模型具有良好的可重復(fù)性和可靠性，不伴有多器官的損害，受損因素單一，有利于目的研究； 2．細(xì)菌感染與免疫排斥反應(yīng)的協(xié)同作用降低了CCR5mRNA的表達(dá)，增加了CCR3和MCP-1mRNA的表達(dá)，從而使免疫排斥反應(yīng)部分受到抑制； 3．細(xì)菌感染和免疫排斥反應(yīng)均能增加淋巴細(xì)胞的功能，但二者的同時(shí)作用使淋巴細(xì)胞功能下降，CD4<'+>/CD8<'+>比值降低，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化； 4．肝移植術(shù)后細(xì)菌感染促進(jìn)了Tre