SPAG8(Sperm associated antigen8)，一個(gè)新的睪丸特異性共激活子.pdf

1、精子發(fā)生是指從精原干細(xì)胞經(jīng)過一系列的有絲分裂和減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體的圓形精子細(xì)胞，這些細(xì)胞再經(jīng)過巨大的形態(tài)重構(gòu)而最終分化成成熟精子的過程。這一復(fù)雜過程受到多種階段特異性和細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。因而，揭示生精細(xì)胞中參與基因調(diào)控的、睪丸特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)的特征及其功能對(duì)于闡明精子發(fā)生的機(jī)理具有極其重要的價(jià)值。
　　 本實(shí)驗(yàn)室曾應(yīng)用含抗精子抗體、可引起精子凝集的不孕婦女患者的血清篩選人睪丸λgt11 cDNA表達(dá)型文庫獲得了一個(gè)新基因

2、，命名為HSD-1，其GenBank接受號(hào)為U12978。該基因編碼523個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)被命名為hSMP-1。2003年人類基因命名數(shù)據(jù)庫將其統(tǒng)一命名為SPAG8（Sperm associated antigen）。熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示SPAG8基因位于人類第9號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶至1區(qū)3帶，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，其在mRNA水平上存在多種剪接方式。多組織Northern blot分析顯示SPAG8基因僅僅在睪丸組織中特異

3、性高表達(dá)，大鼠睪丸組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SPAG8蛋白定位于圓形精子細(xì)胞和長(zhǎng)形精子細(xì)胞內(nèi)，這些結(jié)果提示SPAG8可能參與了精子發(fā)生過程。以SPAG8蛋白的C端序列作為誘餌，篩選人睪丸cDNA表達(dá)文庫，獲得多個(gè)與SPAG8蛋白可能存在相互作用的有意義克隆，其中一個(gè)克隆經(jīng)序列比對(duì)后分析發(fā)現(xiàn)，與activator of CREM in testis（ACT）基因吻合。
　　 在雄性生殖細(xì)胞分化過程中，減數(shù)分裂后活化的許多基因的啟動(dòng)

4、子區(qū)部含有cAMP應(yīng)答元件（CREs），這些元件可以募集轉(zhuǎn)錄因子CREB（CRE-binding protein）家族中的一個(gè)成員cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)子（CREM）。由于選擇性的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和選擇性的剪接等因素，crem基因編碼的產(chǎn)物包括激活型CREM（CREMτ）和抑制型的CREM。CREMτ從粗線期精母細(xì)胞開始大量表達(dá)，它調(diào)控多種減數(shù)分裂后特異的、關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄。已證實(shí)CREM靶向突變小鼠的精子發(fā)生完全停滯于圓形精子細(xì)胞階段，說明了它

5、在生殖細(xì)胞的分化過程發(fā)揮了極其重要的作用。CREMτ的活化方式在體細(xì)胞和在生殖細(xì)胞內(nèi)是不同的：在體細(xì)胞中它的活化依賴其P-box結(jié)構(gòu)域中117Ser被蛋白激酶A磷酸化后與CBP（CREB-binding protein）或p300等共激活子結(jié)合而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄；在生殖細(xì)胞中它則是通過與其睪丸特異性表達(dá)的激活子ACT結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄激活物來調(diào)節(jié)特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄，這種活化過程并不依賴CREMτ的磷酸化以及與CBP等蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而為CR

6、EMτ提供了一條組織特異性的活化途徑。
　　 本論文在酵母雙雜交結(jié)果的基礎(chǔ)上，著重通過對(duì)SPAG8與ACT蛋白之間關(guān)系的研究來探討SPAG8蛋白在ACT調(diào)節(jié)的CREM的轉(zhuǎn)錄激活過程中發(fā)揮的功能。
　　 研究顯示，SPAG8在睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)以及在生精細(xì)胞中的分布與ACT蛋白存在著時(shí)間和空間上的吻合。SPAG8蛋白在小鼠出生后第三周的睪丸中開始出現(xiàn)表達(dá)，第四周時(shí)急劇增多并一直升高到成年時(shí)期。ACT蛋白主要從第四周時(shí)大量

7、表達(dá)直至成年。這表明兩者在發(fā)育時(shí)間上是有重合的。SPAG8蛋白定位在圓形精子細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)、長(zhǎng)形精子細(xì)胞的胞漿內(nèi)，這與ACT蛋白在精子細(xì)胞中的表達(dá)分布也有重合。但SPAG8并不僅限于ACT蛋白所存在的細(xì)胞內(nèi)，我們還發(fā)現(xiàn)SPAG8蛋白在成熟精子的頭部背側(cè)以及尾部均有表達(dá)，這說明SPAG8在成熟精子中也發(fā)揮著作用。
　　 在進(jìn)一步的研究中，我們分別選用了體外和體內(nèi)兩種體系確證了SPAG8和ACT的相互作用。首先，利用原核表達(dá)系統(tǒng)

8、表達(dá)和純化了融合蛋白GST-ACT，將等量的小鼠睪丸組織抽提液分別與純化的GST-ACT和GST進(jìn)行孵育，再加入Glutathione Sepharose4B樹脂進(jìn)行GST pulldown實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)睪丸組織中的SPAG8蛋白與GST-ACT能夠同時(shí)被Glutathione Sepharose4B樹脂結(jié)合下來，說明這兩種蛋白質(zhì)在體外能發(fā)生相互作用。為了在體內(nèi)系統(tǒng)中驗(yàn)證SPAG8和ACT蛋白的相互作用，我們將Myc-SPAG8和Fla

9、g-ACT的表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。分別用抗Flag和抗Myc的抗體進(jìn)行沉淀，結(jié)果顯示過表達(dá)的SPAG8能與ACT蛋白相結(jié)合。通過將SPAG8與ACT分別進(jìn)行缺失突變后尋找彼此的結(jié)合位點(diǎn)，免疫共沉淀結(jié)果顯示，SPAG8蛋白除了N端的140個(gè)氨基酸長(zhǎng)度區(qū)域不參與同ACT蛋白的結(jié)合外，其它區(qū)域均與ACT蛋白結(jié)合。而ACT蛋白中的第2個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)ACT與SPAG8蛋白結(jié)合的主要部位。
　　 由于ACT通過與CREM

10、τ蛋白結(jié)合而有力地激活了CREMτ的轉(zhuǎn)錄活性，我們又證實(shí)SPAG8能夠與ACT相互結(jié)合，所以我們推測(cè)SPAG8可能影響ACT-CREMτ復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。為了支持這一觀點(diǎn)，我們用雙熒光素酶報(bào)告基因分析的方法進(jìn)行驗(yàn)證。以Ga14DBD-CREMτAD可自動(dòng)結(jié)合并激活含Ga14結(jié)合元件的報(bào)告基因活性建立報(bào)告基因體系平臺(tái)。在ACT存在的條件下加入劑量逐漸增加的SPAG8表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPAG8能夠以劑量依賴的方式增強(qiáng)ACT調(diào)節(jié)的Ga1

11、4DBD-CREMτ的轉(zhuǎn)錄活性。將報(bào)告基因上游的啟動(dòng)子區(qū)換成CREMτ靶基因上游的特異性結(jié)合元件CREs時(shí)，SPAG8同樣能夠增強(qiáng)ACT-CREMτ的轉(zhuǎn)錄激活活性。這些結(jié)果提示SPAG8具有增強(qiáng)ACT-CREMτ睪錄激活的能力。我們進(jìn)一步用免疫共沉淀的方法研究了SPAG8蛋白是如何發(fā)揮作用的?通過免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)SPAG8與CREMτ之間并不相互結(jié)合；當(dāng)SPAG8，ACT和CREMτ三者共存在時(shí)，SPAG8能夠明顯地增強(qiáng)ACT和CR

12、EMτ之間的結(jié)合。結(jié)果提示SPAG8可能是通過增強(qiáng)ACT與CREMτ蛋白質(zhì)的結(jié)合而使ACT-CREMτ復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄激活活性增強(qiáng)的。由于CREMτ在體細(xì)胞內(nèi)的活化方式與生殖細(xì)胞不同，因此為了觀察在體細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的SPAG8對(duì)ACT與CREMτ的轉(zhuǎn)錄激活作用是否受到CREMτ的磷酸化影響，我們將CREMτ的117位絲氨酸位點(diǎn)突變成甘氨酸后進(jìn)行研究。報(bào)告基因分析結(jié)果提示SPAG8增強(qiáng)ACT與CREMτ的轉(zhuǎn)錄激活作用并不依賴于CREMτ磷酸化位