一個(gè)新的Arf6特異性GTP酶激活蛋白ACAP4的發(fā)現(xiàn)與功能研究.pdf

1、ADP核糖基化因子(Arfs)是真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)的且是高度保守的GTP結(jié)合蛋白家族，是Ras超家族成員之一。從生化特性和序列的相似性上，Arfs蛋白分為Arf蛋白和Arf相似蛋白。Arf蛋白可再被劃分為三類，第一類包括Arf1，Arf2和Arf3；第二類包括Arf4和Arf5；第三類只有Arf6。與其它的GTP結(jié)合蛋白一樣，Arfs蛋白在功能上是一個(gè)分子開關(guān)，在GTP結(jié)合狀態(tài)和GDP結(jié)合狀態(tài)之間循環(huán)，它與許多不同的靶蛋白結(jié)合影響一系列

2、細(xì)胞事件。Arf6是唯一在細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)揮功能的Arf蛋白，GTP結(jié)合的Arf6調(diào)節(jié)內(nèi)吞膜的運(yùn)輸，同時(shí)調(diào)節(jié)在細(xì)胞外周的細(xì)胞骨架變化。對(duì)Arf6的功能來說，關(guān)鍵性因素是GTP結(jié)合狀態(tài)的時(shí)期，細(xì)胞內(nèi)Arf6與GTP結(jié)合或與GDP結(jié)合是分別由鳥苷交換因子和GTP酶激活蛋白(GAPs)協(xié)調(diào)來實(shí)現(xiàn)的。GAPs是Arf功能關(guān)鍵性調(diào)節(jié)子，控制Arf回到失活的GDP結(jié)合狀態(tài)。據(jù)報(bào)道Arf6的周期性變化是調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞侵襲的必需條件，然而，Arf6介導(dǎo)的細(xì)

3、胞遷移的分子機(jī)制了解依然很少。 為了系統(tǒng)地分析在細(xì)胞遷移過程中，參與調(diào)節(jié)Arf6活性的蛋白，利用功能蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，通過質(zhì)譜鑒定篩選特異地與激活態(tài)的Arf6結(jié)合的蛋白。我們鑒定了一個(gè)Arf蛋白新的GTP酶激活蛋白，根據(jù)它包含的保守的結(jié)構(gòu)特征，命名為ACAP4。和以前描述的Arf激活蛋白ASAP1，PAP/PAG3及ACAP1/2一樣，ACAP4被劃入AZAP蛋白家族，它們擁有許多共同的結(jié)構(gòu)基序，包括兩個(gè)coiled-coil結(jié)

4、構(gòu)，一個(gè)PH結(jié)構(gòu)，一個(gè)GAP結(jié)構(gòu)以及兩個(gè)ANK重復(fù)結(jié)構(gòu)。 我們生化結(jié)果證明ACAP4有磷酸肌醇依賴的GAP活性，ACAP4是一個(gè)Arf6特異的GTP酶激活蛋白。體外活性檢測(cè)結(jié)果顯示Arf6是ACAP4的偏好底物，而不是Arf1和Arf5蛋白。在HeLa細(xì)胞中，過表達(dá)ACAP4能抑制AlF4誘導(dǎo)的Arf6依賴的膜突起的形成。另外，ACAP4被募集到細(xì)胞外周，管狀的膜結(jié)構(gòu)上，Arf6的激活引起內(nèi)吞膜重新回到細(xì)胞質(zhì)膜。在非EGF的刺激

5、下，ACAP4的過表達(dá)抑制Arf6被募集到膜皺褶處，但是在EGF的刺激下，ACAP4與Arf6共定位于actin豐富的膜皺褶上。ACAP4和actin聚合相關(guān)蛋白N-WASP相互作用，它們也共定位于膜皺褶上，暗示ACAP4可能以不依賴GAP活性的方式調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架。表達(dá)GTP水解缺失的突變體Arf6Q67L導(dǎo)致ACAP4和Arf6在胞漿內(nèi)PIP2豐富的膜上積聚，暗示GTP的水解是Arf6依賴的膜-細(xì)胞骨架的重排所必需的。值得注意

6、地是，在傷口復(fù)原實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)RNA干擾技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)ACAP4的表達(dá)下調(diào)或是轉(zhuǎn)染Arf6的GTP水解GAP活性缺失突變體過表達(dá)能抑制Arf6依賴的細(xì)胞遷移，證明ACAP4在細(xì)胞遷移中有非常重要的作用，我們的研究也為研究Arf6介導(dǎo)的細(xì)胞遷移揭示了新的方向。此外，我們的初步研究揭示Arf6與ACAP4在一些高遷移潛能腫瘤細(xì)胞株中的高表達(dá)，進(jìn)一步功能鑒定正在進(jìn)行中。 綜上所述，ACAP4是一個(gè)新的Arf6特異性GTP酶激活蛋白，調(diào)節(jié)