色素上皮源性因子治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的機(jī)理研究.pdf

1、目的：糖尿病是一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，已成為世界范圍的威脅人類健康的疾病。每年約有數(shù)以百萬(wàn)糖尿病患者因其并發(fā)癥而致殘或死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見(jiàn)眼部微血管并發(fā)癥，也是致盲的重要眼病之一。因此如何早期預(yù)防和診治，減少DR的發(fā)生，降低致盲率，已成為世人尤以關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題。DR最主要的病理改變是新生血管形成。研究表明新生血管形成是多種血管生成因子和抑制因子相互拮抗協(xié)同作用的結(jié)果，其中色素上皮源性因子(P

2、EDF)被認(rèn)為是“天然的新生血管抑制物”。PEDF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的新生血管抑制因子，其在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。本研究通過(guò)建立1型糖尿病SD大鼠模型，觀察玻璃體內(nèi)注射PEDF對(duì)早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治作用，探討PEDF在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。
　　 方法：選取8周齡的健康雄性SD大鼠40只，體重200-220g，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（CON組）、糖尿病組(DM組)、糖尿病PED

3、F注射組（DM+PEDF組）和糖尿病生理鹽水注射組（DM+NS組），每組10只。組間大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，糖尿病組大鼠禁食12小時(shí)后左下腹腔給予鏈脲佐菌素（STZ，0，1mmol/L，檸檬酸鈉配制，pH4.5）65mg/kg注射。注射后48小時(shí)選取尾靜脈測(cè)血糖≥16.8mmol/L作為1型糖尿病動(dòng)物模型。糖尿病模型建立后，正常對(duì)照組和DM組不做任何處理，DM+PEDF組在糖尿病模型建立后1

4、周和2周時(shí)分別向玻璃體腔內(nèi)注射PEDF2ug/8ul，而DM+NS組注射同樣體積的生理鹽水。于糖尿病模型建立后3周時(shí)處死動(dòng)物，摘除眼球制作標(biāo)本，進(jìn)行組織病理學(xué)及電鏡觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核數(shù)目，電鏡下觀察視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)的改變。并采用免疫組化方法檢測(cè)視網(wǎng)膜PEDF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、炎性相關(guān)因子-細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）以及細(xì)胞通透性相關(guān)因

5、子-緊密連接蛋白1(ZO-1)以及蛋白激酶B(PKB，又稱Akt)等在蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±SD(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差)表示，應(yīng)用方差分析計(jì)算組間的差異。p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.001被認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、糖尿病大鼠的成模率和死亡率
　　 30只大鼠接受STZ注射，28只成模，均為一次注射成模，成模率93.3％。DM+PEDF以及DM組分別有1只大鼠在試驗(yàn)中死亡。故糖尿病組

6、大鼠死亡率為7。1％。
　　 2、糖尿病大鼠體重以及血糖的變化
　　 同CON組大鼠相比，糖尿病組大鼠，即DM、DM+NS，DM+PEDF組大鼠的血糖在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均中明顯升高，而三組接受不同處理的糖尿病組大鼠間血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 同正常同齡對(duì)照組大鼠相比，糖尿病大鼠體重明顯降低，且這種體重的差異有隨著病程的延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)。
　　 3、眼底表現(xiàn)
　　 同CON組大鼠相比，1型糖尿病程為

7、3周的大鼠晶狀體透明，眼底未見(jiàn)明顯改變。
　　 4、視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的變化
　　 在透射電鏡下，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，DM組大鼠視網(wǎng)膜可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水腫，線粒體腫脹變大，基質(zhì)腫脹明顯，可見(jiàn)大部分或全部的嵴消失，部分雙側(cè)膜融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。玻璃體內(nèi)PEDF注射可以明顯的改善這一病理改變，而玻璃體內(nèi)注射生理鹽水則無(wú)此作用。
　　 5、視網(wǎng)膜PEDF與VEGF的表達(dá)變化
　　

8、 在正常對(duì)照組與3周1型糖尿病病程的大鼠中，PEDF與VEGF的表達(dá)都很少，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層等細(xì)胞中。各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明3周糖尿病的病程尚不能引起視網(wǎng)膜表達(dá)PEDF以及VEGF的變化，玻璃體內(nèi)PEDF注射似乎可以增加PEDF的表達(dá)，減少VEGF的表達(dá)，但相對(duì)于DM以及DM+NS無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 6、PEDF干預(yù)可以減少炎性相關(guān)因子ICAM-1以及MCP-1的表達(dá)
　　 正常

9、對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中ICAM-1以及MCP-1表達(dá)極少，同正常對(duì)照組相比，3周糖尿病病程可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜ICAM-1以及MCP-1的表達(dá)明顯增加，玻璃體內(nèi)PEDF注射可以明顯減少ICAM-1以及MCP-1的表達(dá)，而注射NS則無(wú)此種作用。表明PEDF通過(guò)減少一些炎性因子的表達(dá)改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展。
　　 7、PEDF干預(yù)可以增加視網(wǎng)膜細(xì)胞連接蛋白ZO-1以及相關(guān)因子Akt的表達(dá)
　　 在正常組大鼠視網(wǎng)膜中，ZO-1蛋白主

10、要表達(dá)于內(nèi)核層的細(xì)胞以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，糖尿病3周時(shí)ZO-1蛋白的表達(dá)明顯減少，而PEDF注射能增加內(nèi)核層以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的ZO-1蛋白的表達(dá)。在正常大鼠的視網(wǎng)膜中，Akt主要表達(dá)于內(nèi)叢狀層以及脈絡(luò)膜的細(xì)胞漿中。糖尿病3周時(shí)內(nèi)叢狀層中的Akt較正常對(duì)照組明顯減少，PEDF治療可使糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層中Akt表達(dá)增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、同正常對(duì)照組相比，糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙冢?周病程）時(shí)視網(wǎng)膜VEGF以及PEDF均無(wú)

11、表達(dá)變化；
　　 2、糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙跁r(shí)已出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，而PEDF治療可以改善視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷并有一定保護(hù)作用；
　　 3、糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙跁r(shí)已出現(xiàn)視網(wǎng)膜炎性相關(guān)因子ICAM-1及MCP-1的表達(dá)增加，PEDF玻璃體內(nèi)注射可以減少視網(wǎng)膜炎性相關(guān)因子的表達(dá)；
　　 4、糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙跁r(shí)視網(wǎng)膜ZO-1以及Akt的表達(dá)明顯減少，而PEDF玻璃體內(nèi)注射可以增加細(xì)胞連接蛋白以及相關(guān)