萬古霉素高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究.pdf

1、本文根據(jù)萬古霉素的生物合成途徑，對萬古霉素產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis，AO-1)進(jìn)行核糖體誘變抗性選育，以期獲得高產(chǎn)菌株。通過對高產(chǎn)菌株搖瓶培養(yǎng)基的優(yōu)化，獲得該菌株的最適培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，對高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，摸索放大培養(yǎng)的條件，為生產(chǎn)技術(shù)工業(yè)化做初步的準(zhǔn)備。 首先對出發(fā)菌株AO-1的培養(yǎng)基種類進(jìn)行了篩選，確定高氏1號液體培養(yǎng)基為搖瓶發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基，出發(fā)菌株AO-1在該培養(yǎng)基

2、中培養(yǎng)生產(chǎn)萬古霉素的產(chǎn)量為1.25 g L-1。 以AO-1為出發(fā)菌株，確定AO-1對萬古霉素的最低抑制濃度(MIC)為5 mgL-1，對鏈霉素的MIC為150 mg L-1。使用MIC的不同倍數(shù)濃度的萬古霉素、鏈霉素以及萬古霉素-鏈霉素復(fù)合梯度抗性平板對出發(fā)菌株AO-1進(jìn)行突變初篩和復(fù)篩，最終獲得4株高產(chǎn)菌株：V250-12、V750-3、V250-S100-5以及V500-S400-1，其萬古霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株分別提高了31

3、.7％、50.5％、76.8％和88.8％。對V500-S400-1以及V250-S100-5進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明菌株V500-S400-1連續(xù)傳代5次后萬古霉素產(chǎn)量穩(wěn)定性高達(dá)90.9％。 對高產(chǎn)菌株A.orientalis V500-S400-1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。首先利用單因素實(shí)驗(yàn)法考察了碳氮源種類、碳氮源初始濃度、K2HPO4等對萬古霉素發(fā)酵的影響，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對萬古霉素產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化，獲得最

4、佳培養(yǎng)基組成為(gL-1)：土豆蛋白17.362，KNO32，甘油52.733，NaCl0.5，K2HPO4·3H2O0.103，MgSO4·7H2O0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)120 h后，萬古霉素產(chǎn)量高達(dá)7.61 g L-1，是出發(fā)菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得產(chǎn)量(3.5 g L-1)的2.17倍，是在出發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲產(chǎn)量(1.25 gL-1)的6.09倍。 在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對