CEACAM6在胃癌中生物學(xué)功能和分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：CEACAM6在諸多腫瘤中表達(dá)上調(diào)，本研究旨在闡明CEACAM6在胃癌中表達(dá)的臨床意義，并探討CEACAM6在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用；觀察過表達(dá)CEACAM6后，胃癌細(xì)胞SGC-7901原癌基因c-Src基因表達(dá)及活性改變。
　　方法：以qRT-PCR方法檢測51例胃癌病人術(shù)后標(biāo)本中胃癌組織和癌旁非腫瘤組織中CEACAM6的mRNA表達(dá)；組織芯片免疫組織化學(xué)（I H C)方法檢測101例胃癌病人術(shù)后標(biāo)本中胃癌組織和癌旁非腫瘤

2、組織中CEACAM6的蛋白表達(dá)，并利用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析該101例胃癌病人CEACAM6的蛋白表達(dá)與相對應(yīng)的臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　利用流式細(xì)胞儀檢測9株胃癌細(xì)胞株及1株永生化胃粘膜細(xì)胞株(GES-1)中CEACAM6的表達(dá)；在高表達(dá)CEACAM6的 SNU-16細(xì)胞中進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察CEACAM6在細(xì)胞中的定位；利用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)SNU-16、MKN-28細(xì)胞CEACAM6表達(dá)，以qRT-PCR和We

3、stem blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下調(diào)效果；Transwell細(xì)胞迀移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測CEACAM6下調(diào)后，SNU-16、MKN-28細(xì)胞的迀移和侵襲能力的改變。
　　以RT-PCR方法從SNU-16細(xì)胞CEACAM6 cD N A中擴(kuò)增CEACAM6的編碼區(qū)片段，連入19T-simple Vector克隆載體，經(jīng)過酶切測序驗(yàn)證后插入pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體中，再次酶切測序驗(yàn)證，得到CEACAM6的真核過表達(dá)載體（命名為：pIRE

4、S2-EGFP/CEACAM6); pIRES2-EGFP/CEACAM6及pIRES2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEACAM6低表達(dá)的SGC-7901、M K N-45胃癌細(xì)胞，并通過 G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)CEACAM6細(xì)胞株（SGC-7901/CEACAM6和MKN-45/CEACAM6)及其陰性對照組 SGC-7901/vector和 MKN-45/vector)，qRT-PCR及Westem b lo t驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　　T

5、ranswell細(xì)胞迀移、侵襲、流式細(xì)胞凋亡檢測以及失巢凋亡檢測實(shí)驗(yàn)檢測CEACAM6過表達(dá)后SGC-7901、MKN-45細(xì)胞迀移、侵襲、凋亡的改變；CEACAM6單抗處理 SGC-7901/CEACAM6、MKN-45/CEACAM6細(xì)胞后，檢測其細(xì)胞迀移和侵襲能力的改變；裸鼠尾靜脈成瘤模型檢測CEACAM6過表達(dá)后SGC-7901細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)形成的改變，H&E染色驗(yàn)證腫瘤結(jié)節(jié)；Westem b lo t實(shí)驗(yàn)檢測SGC-

6、7901細(xì)胞過表達(dá)CEACAM6后 C-SRC和磷酸化C-SRC(P-C-SRC)蛋白豐度的變化。
　　結(jié)果：51例胃癌患者術(shù)后標(biāo)本中腫瘤組織中CEACAM6基因相對表達(dá)量明顯高于癌旁非腫瘤組織（中位數(shù):19.100 vs7.040，p=0.021)，其中58.8％(30/51)患者腫瘤組織CEACAM6mRNA表達(dá)高于其對應(yīng)的癌旁非腫瘤組織;101例胃癌患者術(shù)后標(biāo)本中腫瘤組織CEACAM6蛋白表達(dá)明顯高于癌旁非腫瘤組織（免疫組織

7、化學(xué)染色得分：6.37±3.82 vs2.40±1.53(p=0.000)，其中78.2%(79/101)患者腫瘤組織CEACAM6蛋白表達(dá)高于其對應(yīng)的癌旁非腫瘤組織；CEACAM6蛋白過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（p=0.001)，CEACAM6蛋白表達(dá)越高，更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：9株胃癌細(xì)胞株CEACAM6表達(dá)均高于永生化胃粘膜細(xì)胞株，10株細(xì)胞CEACAM6表達(dá)量由高到低依次為:SNU-16>MK

8、N-28>KATOIII>SGC7901>AGS>NCL-87>MKN-45> SNU-1>823> GES-1。SNU-16細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CEACAM6定位于細(xì)胞膜表面。通過qRT-PCR和West em blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)siRNA介導(dǎo)的MKN-28、SNU-16細(xì)胞CEACAM6表達(dá)下調(diào)成功。CEACAM6表達(dá)下調(diào)后，MKN-28細(xì)胞的迀移和侵襲能力分別下降57.11%和85.54%，SNU-16細(xì)胞的迀移和侵襲能力分別下

9、降52.08%和90.77%。
　　以SNU-16細(xì)胞cDNA為模板成功克隆出CEACAM6編碼區(qū)片段，將其連接入19T-simple Vector克隆載體中測序正確。進(jìn)一步將CEACAM6編碼區(qū)片段從19T-s imple Vector克隆載體中成功酶切并插入pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體，再次測序正確，從而成功建立pIRES2-EGFP/CEACAM6真核表達(dá)載體。基于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418篩選技術(shù)，SGC-7901/vec

10、tor、SGC-7901/CEACAM6、MKN-45/vector、MKN-45/CEACAM6四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株成功建立，并且以qRT-PCR及Westem blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)CEACAM6的表達(dá)上調(diào)成功。
　　CEACAM6過表達(dá)后SGC-7901、MKN-45細(xì)胞迀移能力分別增加5倍和2倍，p<0.01;侵襲能力分別增加2.5倍和2.1倍，p<0.01;凋亡細(xì)胞數(shù)量分別下降了46.20%和71.72%，p<0.01;失巢凋亡數(shù)量

11、分別下降了53.25%和76.15%，p<0.01。CEACAM6單抗處理SGC-7901/CEACAM6、MKN-45/CEACAM6細(xì)胞，可部分阻斷其迀移和侵襲能力的增加。尾靜脈注射裸鼠模型顯示SGC-7901細(xì)胞過表達(dá)C EACAM6后肝臟、肺臟等臟器轉(zhuǎn)移灶相比陰性對照組形成明顯，p<0.01。過表達(dá)CEACAM6后C-SRC蛋白豐度無明顯變化，P-C-SRC蛋白豐度明顯升高，提示C-SRC蛋白活性升高。
　　結(jié)論：CEAC