心臟Telocytes分子和功能特性及其心臟生物學研究.pdf

1、新近研究證實一類新型的間質(zhì)細胞存在，其特征是伴有長（數(shù)十至數(shù)千微米不等）而纖細（直徑寬約0.1-0.5微米）的突起。該群細胞被命名為telocytes，其突起命名為Telopodes。迄今，在包括心臟在內(nèi)的哺乳動物多臟器中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Telocytes的空間分布。通過Telopodes，Telocytes能夠與其他類別的心臟原位細胞，毛細血管或者神經(jīng)末梢相互作用。并且，他們一同組成一個間質(zhì)系統(tǒng)，能夠起作用于心臟更新，再生以及修復。雖然一些與

2、協(xié)調(diào)相關的功能在當前已有所研究，例如對心外膜干細胞池中的心肌祖細胞的調(diào)控以及在心肌梗死病理下血管新生，然而，涉及這些機制的系統(tǒng)化研究需要從心臟組織中純化此類細胞。
　　在Telocytes特有的細胞形態(tài)之外，其分子生物標記也已有所明確。相應于此，我們運用流式細胞儀，以其細胞膜表面CD34和CD117為分子靶向，成功的分離出心臟Telocytes。基于純化細胞的基礎上，此后相繼開展了電生理、生物化學以及蛋白質(zhì)組學技術從而進一步揭示此

3、類細胞的基本特性。同時，也發(fā)現(xiàn)了心臟Telocytes能夠通過旁分泌方式和促進微血管內(nèi)皮細胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子方式來加快微血管內(nèi)皮細胞增殖。上述發(fā)現(xiàn)必將為理解局部血管新生及心臟生理和防護提供新的理念。
　　第一部分心臟Telocytes分離、培養(yǎng)、純化、鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化
　　目的: 純化心臟Telocytes并優(yōu)化其培養(yǎng)基。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，消化法分離心臟原位細胞，依據(jù)細胞間貼壁時間的

4、差異，初步篩選并培養(yǎng)原代心臟Telocytes，借助流式細胞儀純化原代中CD34+/CD117+表達細胞，激光共聚焦顯微鏡掃描Vimentin+表達及普通顯微鏡觀察Telocytes特征形態(tài)。通過CCK-8對Telocytes在4種不同基礎培養(yǎng)基:低糖DMEM伴10％胎牛血清、低糖DMEM伴20％胎牛血清、高糖DMEM伴10％胎牛血清、高糖DMEM伴20％胎牛血清，中增殖活力進行檢測，優(yōu)化適合Telocytes生長環(huán)境。
　　結(jié)果

5、: 原代培養(yǎng)細胞經(jīng)流式細胞儀分析:CD34-/CD117-24.0％, CD34+/CD117-7.4％，CD34-/CD117+4.6％，CD34+/CD117+64％。CD34+/CD117+表達細胞在普通顯微鏡下觀察其特異形態(tài)結(jié)構(gòu):細而長的細胞突起伴不規(guī)則串珠樣膨起，這符合Telocytes的特征性的結(jié)構(gòu)Telopodes; CD34+/CD117+表達細胞在激光共聚焦顯微鏡下可見骨架蛋白Vimentin在胞體和細胞突起的陽性表達

6、，這符合Telocytes CD34+/CD117+/Vimentin+的特異性表達。在4種不同基礎培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn):高糖DMEM伴10％胎牛血清同低糖DMEM伴10％胎牛血清、低糖DMEM伴20％胎牛血清及高糖DMEM伴20％胎牛血清相比較，在1h至4h Telocytes的細胞增殖活力明顯升高。
　　結(jié)論: 在原代細胞培養(yǎng)的基礎上采用CD34+/CD117+表達分選的細胞具備Telocytes特征性結(jié)構(gòu)和蛋白表達，高糖DMEM伴1

7、0％胎牛血清為最優(yōu)Telocytes的培養(yǎng)基。
　　第二部分心臟Telocytes增殖、Telopodes演變及端粒酶活性分析
　　目的: 時序性觀察telocytes的增殖過程及telopodes的生長進程。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，在心臟原代細胞培養(yǎng)的基礎上采用流式細胞儀分選CD34+/CD117+表達的telocytes細胞，將其種植于6孔板中，借助Cell-IQ(R) imaging pl

8、atform定時（20分鐘）連續(xù)（96小時）拍攝telocytes分裂增殖的全部過程以及在telocytes生長進程中細胞突起Telopodes的演變;選取與心臟telocytes同量的骨髓間充質(zhì)干細胞、心臟成纖維細胞以及心肌細胞，通過實時定量PCR測定各組端粒酶濃度的差異。
　　結(jié)果: 在活細胞成像平臺下，貼壁的telocytes在12h開始進入界面構(gòu)象，48h出現(xiàn)雙核及胞體內(nèi)陷的縱向分裂征象，56h可見特征性的telopode

9、s伴隨著子細胞向相反的方向移動而逐漸成形。在telocytes貼壁后的16h-24h，細胞特征性突起telopodes在伴隨細胞生長進程中不斷出現(xiàn)脫落和新生，脫落的telopodes分散成podoms和podomers，布滿在telocytes周圍空間。骨髓間充質(zhì)干細胞、心臟成纖維細胞，心臟telocytes以及心肌細胞中端粒酶檢測濃度分別為0.0668，0.1637，0.0974以及0.0006 amoles/uL。
　　結(jié)論:

10、 縱向分裂的telocytes傳代時程較長，端粒酶活性相對較低，細胞生長過程可見telopodes新生與脫落交替出現(xiàn)，并以podoms和podomers形式存在周圍空間。
　　第三部分心臟Telocytes電生理特性及蛋白質(zhì)組學意義
　　目的: 分析Telocytes的電生理特性及全細胞比較蛋白組學功能趨向。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，在心臟原代細胞培養(yǎng)的基礎上采用流式細胞儀分選CD34+/CD11

11、7+表達的Telocytes細胞，將其種植于Glass BottomDish，運用激光共聚焦顯微鏡掃描Na+，K+，Ca2+離子通道在細胞膜表達;將其種植于圓形載玻片上，在細胞外液140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/LCaCl2,2 mmol/L MgCl2,10 mmol/L HEPES,12 mmol/L glucose,2 mmol/L CoCl2,2 mmol/L4-AP，2mmol/L Ba

12、Cl2，pH7.4，以1.5 mL/min的流速;細胞內(nèi)液130mmol/L K-aspartate,6 mmol/L NaCl,10 mmol/L HEPES,2 mmol/L MgCl2,14mmol/L EGTA，2 mmol/L CaCl2，5mmol/L Na2ATP，pH7.4的環(huán)境下，保持電位為-40 mV，自-110 mV至+10 mV，以階差為20mV，運用全細胞膜片鉗檢測Telocytes的基本電生理特性。提取心臟T

13、elocytes全細胞蛋白，運用同位素標簽相對和絕對定量技術，質(zhì)譜分析肽段并鑒定蛋白組分，同時，與心臟干細胞、心臟微血管內(nèi)皮細胞及心臟神經(jīng)嵴細胞之間蛋白定量比較，分析心臟Telocytes全細胞蛋白相對功能趨向。
　　結(jié)果: 激光共聚焦顯微鏡掃描心臟Telocytes可見胞體及細胞突起膜表面Na+，K+，Ca2+離子通道分布表達;運用全細胞膜片鉗技術將Ca2+染色指示劑Fura-2注入胞體觀察到Telocytes特征性形態(tài)以及胞體

14、強表達和podomers、podoms弱表達;刺穿細胞膜后檢測Telocytes平均電容和平均電阻分別為22.53 pF和15.65 GΩ;自-110 mV至+10 mV誘發(fā)Telocytes，未見動作電位出現(xiàn)。心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細胞、心臟干細胞及心臟神經(jīng)嵴細胞全細胞比較蛋白組學發(fā)現(xiàn)分別存在16，32及90個差異表達蛋白，Telocytes分別上調(diào)表達:細胞成分的形態(tài)發(fā)生(K2C7，CTRO)，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸(SN

15、AG，F(xiàn)LOT2，GBLP)，和代謝過程(GLO2，VPS4B);核mRNA剪接(SFRS5)，代謝過程(NOL5A,IDH3A)，免疫系統(tǒng)的過程(SAA3)和運輸(FABP4);細胞運動(MYH9，ODFP2)，細胞成分的形態(tài)發(fā)生(MYH9，LMNA，SPTA2，K1Cl3)，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸(RAB31，CHMP3，ARF3，NIPS1)，細胞內(nèi)氨基酸的生物合成和代謝過程(AL4Al，SCLY, AATM，MMSA，ClTC，GLS

16、L，PROD2)，免疫系統(tǒng)的過程(SODM，CATA, SBP1, MOSC2, GSTM1, PRDX6, THTR, DNJA3, BPHL, PPIA, EST31,GST01)，蛋白合成與代謝過程(TCPQ，CH10，TCPB，UK114，CALR，TCPZ，TCPG)，呼吸鏈電子傳遞和三羧酸循環(huán)(QCR1，ETFD，MDHC，ODO1，SUCB2，CP2CT)。
　　結(jié)論: 心臟Telocytes膜表面存在Na+，K+，

17、Ca2+離子通道，但沒有動作電位發(fā)生，細胞間不以電信號傳遞;差異蛋白組學提示心臟Telocytes在細胞成分的形態(tài)發(fā)生等方面高表達。
　　第四部分心臟Telocytes空間分布及其對微血管內(nèi)皮細胞增殖影響
　　目的: 觀察心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細胞空間毗鄰位置關系以及對其增殖的影響。
　　方法: 將6周齡的C57BL/6J小鼠心臟，分離成1mm3大小，經(jīng)4％戊二醛(pH7.3)在4℃固定4h，后經(jīng)沖洗、

18、梯度脫水、浸潤、包埋，加工超薄切片(70nm)，鋪Formvar-coated銅網(wǎng)，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察心臟Telocytes形態(tài)及與心臟微血管內(nèi)皮細胞空間毗鄰位置關系。分離心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細胞，運用Transwell技術將兩者共培養(yǎng)72 h，采用碘化吡啶染色心臟微血管內(nèi)皮細胞核，借助流式細胞儀分析共培養(yǎng)組及對照組心臟微血管內(nèi)皮細胞之間細胞周期的差異。
　　結(jié)果: 透射電鏡下，心臟Telocy

19、tes位于心臟間質(zhì)，心肌束之間，特征性結(jié)構(gòu)Telopodes圍繞在微血管周圍，與微血管內(nèi)皮細胞毗鄰。Transwell技術共培養(yǎng)心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn):共培養(yǎng)組S+G2/M期15.3％+11.7％，對照組S+G2/M期11.8％+5.56％。
　　結(jié)論: 心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細胞之間存在重要的毗鄰空間位置關系，且心臟Telocytes旁分泌明顯促進心臟微血管內(nèi)皮細胞增殖。
　　第五部

20、分心臟Telocytes旁分泌及其促微血管內(nèi)皮細胞自分泌研究
　　目的: 分析心臟Telocytes旁分泌細胞因子、生物功能，及其對微血管內(nèi)皮細胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子的影響。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，在心臟原代細胞培養(yǎng)的基礎上采用流式細胞儀分選CD34+/CD117+表達的Telocytes細胞，將其種植于6孔板中，貼壁后，無血清連續(xù)培養(yǎng)48 h，分別在0，6，12，24和48 h取上清液，運用細胞因

21、子抗體芯片技術，定量檢測120種細胞因子，選取48 h時終濃度大于100 pg/mL的細胞因子，并分析其參與機體生物功能。運用Transwell技術將心臟Telocytes和微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)72 h后，分別在2，6，12，24，48及72 h收集微血管內(nèi)皮細胞無血清培養(yǎng)基，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗技術定量檢測血管內(nèi)皮生長因子含量。
　　結(jié)果: 在48小時選取終點，36種細胞因子濃度大于100 pg/mL，主要涉及免疫反應、炎癥反應