心臟Telocytes分子和功能特性及其心臟生物學(xué)研究.pdf

1、新近研究證實(shí)一類新型的間質(zhì)細(xì)胞存在，其特征是伴有長(zhǎng)（數(shù)十至數(shù)千微米不等）而纖細(xì)（直徑寬約0.1-0.5微米）的突起。該群細(xì)胞被命名為telocytes，其突起命名為Telopodes。迄今，在包括心臟在內(nèi)的哺乳動(dòng)物多臟器中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Telocytes的空間分布。通過(guò)Telopodes，Telocytes能夠與其他類別的心臟原位細(xì)胞，毛細(xì)血管或者神經(jīng)末梢相互作用。并且，他們一同組成一個(gè)間質(zhì)系統(tǒng)，能夠起作用于心臟更新，再生以及修復(fù)。雖然一些與

2、協(xié)調(diào)相關(guān)的功能在當(dāng)前已有所研究，例如對(duì)心外膜干細(xì)胞池中的心肌祖細(xì)胞的調(diào)控以及在心肌梗死病理下血管新生，然而，涉及這些機(jī)制的系統(tǒng)化研究需要從心臟組織中純化此類細(xì)胞。
　　在Telocytes特有的細(xì)胞形態(tài)之外，其分子生物標(biāo)記也已有所明確。相應(yīng)于此，我們運(yùn)用流式細(xì)胞儀，以其細(xì)胞膜表面CD34和CD117為分子靶向，成功的分離出心臟Telocytes?；诩兓?xì)胞的基礎(chǔ)上，此后相繼開(kāi)展了電生理、生物化學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從而進(jìn)一步揭示此

3、類細(xì)胞的基本特性。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了心臟Telocytes能夠通過(guò)旁分泌方式和促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子方式來(lái)加快微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。上述發(fā)現(xiàn)必將為理解局部血管新生及心臟生理和防護(hù)提供新的理念。
　　第一部分心臟Telocytes分離、培養(yǎng)、純化、鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化
　　目的: 純化心臟Telocytes并優(yōu)化其培養(yǎng)基。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，消化法分離心臟原位細(xì)胞，依據(jù)細(xì)胞間貼壁時(shí)間的

4、差異，初步篩選并培養(yǎng)原代心臟Telocytes，借助流式細(xì)胞儀純化原代中CD34+/CD117+表達(dá)細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡掃描Vimentin+表達(dá)及普通顯微鏡觀察Telocytes特征形態(tài)。通過(guò)CCK-8對(duì)Telocytes在4種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基:低糖DMEM伴10％胎牛血清、低糖DMEM伴20％胎牛血清、高糖DMEM伴10％胎牛血清、高糖DMEM伴20％胎牛血清，中增殖活力進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化適合Telocytes生長(zhǎng)環(huán)境。
　　結(jié)果

5、: 原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析:CD34-/CD117-24.0％, CD34+/CD117-7.4％，CD34-/CD117+4.6％，CD34+/CD117+64％。CD34+/CD117+表達(dá)細(xì)胞在普通顯微鏡下觀察其特異形態(tài)結(jié)構(gòu):細(xì)而長(zhǎng)的細(xì)胞突起伴不規(guī)則串珠樣膨起，這符合Telocytes的特征性的結(jié)構(gòu)Telopodes; CD34+/CD117+表達(dá)細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)骨架蛋白Vimentin在胞體和細(xì)胞突起的陽(yáng)性表達(dá)

6、，這符合Telocytes CD34+/CD117+/Vimentin+的特異性表達(dá)。在4種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn):高糖DMEM伴10％胎牛血清同低糖DMEM伴10％胎牛血清、低糖DMEM伴20％胎牛血清及高糖DMEM伴20％胎牛血清相比較，在1h至4h Telocytes的細(xì)胞增殖活力明顯升高。
　　結(jié)論: 在原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用CD34+/CD117+表達(dá)分選的細(xì)胞具備Telocytes特征性結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)，高糖DMEM伴1

7、0％胎牛血清為最優(yōu)Telocytes的培養(yǎng)基。
　　第二部分心臟Telocytes增殖、Telopodes演變及端粒酶活性分析
　　目的: 時(shí)序性觀察telocytes的增殖過(guò)程及telopodes的生長(zhǎng)進(jìn)程。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，在心臟原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀分選CD34+/CD117+表達(dá)的telocytes細(xì)胞，將其種植于6孔板中，借助Cell-IQ(R) imaging pl

8、atform定時(shí)（20分鐘）連續(xù)（96小時(shí)）拍攝telocytes分裂增殖的全部過(guò)程以及在telocytes生長(zhǎng)進(jìn)程中細(xì)胞突起Telopodes的演變;選取與心臟telocytes同量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞以及心肌細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定各組端粒酶濃度的差異。
　　結(jié)果: 在活細(xì)胞成像平臺(tái)下，貼壁的telocytes在12h開(kāi)始進(jìn)入界面構(gòu)象，48h出現(xiàn)雙核及胞體內(nèi)陷的縱向分裂征象，56h可見(jiàn)特征性的telopode

9、s伴隨著子細(xì)胞向相反的方向移動(dòng)而逐漸成形。在telocytes貼壁后的16h-24h，細(xì)胞特征性突起telopodes在伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)程中不斷出現(xiàn)脫落和新生，脫落的telopodes分散成podoms和podomers，布滿在telocytes周圍空間。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞，心臟telocytes以及心肌細(xì)胞中端粒酶檢測(cè)濃度分別為0.0668，0.1637，0.0974以及0.0006 amoles/uL。
　　結(jié)論:

10、 縱向分裂的telocytes傳代時(shí)程較長(zhǎng)，端粒酶活性相對(duì)較低，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程可見(jiàn)telopodes新生與脫落交替出現(xiàn)，并以podoms和podomers形式存在周圍空間。
　　第三部分心臟Telocytes電生理特性及蛋白質(zhì)組學(xué)意義
　　目的: 分析Telocytes的電生理特性及全細(xì)胞比較蛋白組學(xué)功能趨向。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，在心臟原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀分選CD34+/CD11

11、7+表達(dá)的Telocytes細(xì)胞，將其種植于Glass BottomDish，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡掃描Na+，K+，Ca2+離子通道在細(xì)胞膜表達(dá);將其種植于圓形載玻片上，在細(xì)胞外液140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/LCaCl2,2 mmol/L MgCl2,10 mmol/L HEPES,12 mmol/L glucose,2 mmol/L CoCl2,2 mmol/L4-AP，2mmol/L Ba

12、Cl2，pH7.4，以1.5 mL/min的流速;細(xì)胞內(nèi)液130mmol/L K-aspartate,6 mmol/L NaCl,10 mmol/L HEPES,2 mmol/L MgCl2,14mmol/L EGTA，2 mmol/L CaCl2，5mmol/L Na2ATP，pH7.4的環(huán)境下，保持電位為-40 mV，自-110 mV至+10 mV，以階差為20mV，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)Telocytes的基本電生理特性。提取心臟T

13、elocytes全細(xì)胞蛋白，運(yùn)用同位素標(biāo)簽相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)，質(zhì)譜分析肽段并鑒定蛋白組分，同時(shí)，與心臟干細(xì)胞、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞及心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞之間蛋白定量比較，分析心臟Telocytes全細(xì)胞蛋白相對(duì)功能趨向。
　　結(jié)果: 激光共聚焦顯微鏡掃描心臟Telocytes可見(jiàn)胞體及細(xì)胞突起膜表面Na+，K+，Ca2+離子通道分布表達(dá);運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)將Ca2+染色指示劑Fura-2注入胞體觀察到Telocytes特征性形態(tài)以及胞體

14、強(qiáng)表達(dá)和podomers、podoms弱表達(dá);刺穿細(xì)胞膜后檢測(cè)Telocytes平均電容和平均電阻分別為22.53 pF和15.65 GΩ;自-110 mV至+10 mV誘發(fā)Telocytes，未見(jiàn)動(dòng)作電位出現(xiàn)。心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞、心臟干細(xì)胞及心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞全細(xì)胞比較蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)分別存在16，32及90個(gè)差異表達(dá)蛋白，Telocytes分別上調(diào)表達(dá):細(xì)胞成分的形態(tài)發(fā)生(K2C7，CTRO)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸(SN

15、AG，F(xiàn)LOT2，GBLP)，和代謝過(guò)程(GLO2，VPS4B);核mRNA剪接(SFRS5)，代謝過(guò)程(NOL5A,IDH3A)，免疫系統(tǒng)的過(guò)程(SAA3)和運(yùn)輸(FABP4);細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(MYH9，ODFP2)，細(xì)胞成分的形態(tài)發(fā)生(MYH9，LMNA，SPTA2，K1Cl3)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸(RAB31，CHMP3，ARF3，NIPS1)，細(xì)胞內(nèi)氨基酸的生物合成和代謝過(guò)程(AL4Al，SCLY, AATM，MMSA，ClTC，GLS

16、L，PROD2)，免疫系統(tǒng)的過(guò)程(SODM，CATA, SBP1, MOSC2, GSTM1, PRDX6, THTR, DNJA3, BPHL, PPIA, EST31,GST01)，蛋白合成與代謝過(guò)程(TCPQ，CH10，TCPB，UK114，CALR，TCPZ，TCPG)，呼吸鏈電子傳遞和三羧酸循環(huán)(QCR1，ETFD，MDHC，ODO1，SUCB2，CP2CT)。
　　結(jié)論: 心臟Telocytes膜表面存在Na+，K+，

17、Ca2+離子通道，但沒(méi)有動(dòng)作電位發(fā)生，細(xì)胞間不以電信號(hào)傳遞;差異蛋白組學(xué)提示心臟Telocytes在細(xì)胞成分的形態(tài)發(fā)生等方面高表達(dá)。
　　第四部分心臟Telocytes空間分布及其對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響
　　目的: 觀察心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞空間毗鄰位置關(guān)系以及對(duì)其增殖的影響。
　　方法: 將6周齡的C57BL/6J小鼠心臟，分離成1mm3大小，經(jīng)4％戊二醛(pH7.3)在4℃固定4h，后經(jīng)沖洗、

18、梯度脫水、浸潤(rùn)、包埋，加工超薄切片(70nm)，鋪Formvar-coated銅網(wǎng)，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察心臟Telocytes形態(tài)及與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞空間毗鄰位置關(guān)系。分離心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用Transwell技術(shù)將兩者共培養(yǎng)72 h，采用碘化吡啶染色心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞核，借助流式細(xì)胞儀分析共培養(yǎng)組及對(duì)照組心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間細(xì)胞周期的差異。
　　結(jié)果: 透射電鏡下，心臟Telocy

19、tes位于心臟間質(zhì)，心肌束之間，特征性結(jié)構(gòu)Telopodes圍繞在微血管周圍，與微血管內(nèi)皮細(xì)胞毗鄰。Transwell技術(shù)共培養(yǎng)心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn):共培養(yǎng)組S+G2/M期15.3％+11.7％，對(duì)照組S+G2/M期11.8％+5.56％。
　　結(jié)論: 心臟Telocytes與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在重要的毗鄰空間位置關(guān)系，且心臟Telocytes旁分泌明顯促進(jìn)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　第五部

20、分心臟Telocytes旁分泌及其促微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌研究
　　目的: 分析心臟Telocytes旁分泌細(xì)胞因子、生物功能，及其對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響。
　　方法: 利用6周齡的C57BL/6J小鼠，在心臟原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀分選CD34+/CD117+表達(dá)的Telocytes細(xì)胞，將其種植于6孔板中，貼壁后，無(wú)血清連續(xù)培養(yǎng)48 h，分別在0，6，12，24和48 h取上清液，運(yùn)用細(xì)胞因

21、子抗體芯片技術(shù)，定量檢測(cè)120種細(xì)胞因子，選取48 h時(shí)終濃度大于100 pg/mL的細(xì)胞因子，并分析其參與機(jī)體生物功能。運(yùn)用Transwell技術(shù)將心臟Telocytes和微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，分別在2，6，12，24，48及72 h收集微血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)定量檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量。
　　結(jié)果: 在48小時(shí)選取終點(diǎn)，36種細(xì)胞因子濃度大于100 pg/mL，主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)