子癇前期腎損傷標志物及AnG-(1-7)對其足細胞損傷保護作用的研究.pdf

1、第一部分子癇前期腎損傷的臨床研究
　?。ㄒ唬┳影B前期相關危險因素研究
　　目的:
　　通過對臨床病例收集整理及生化指標的檢測，研究子癇前期患者危險因素及其與子癇前期發(fā)病率的相關性。探討不同危險因素對子癇前期患者以及圍生兒不良妊娠結局的影響。
　　方法:
　　收集2011年5月-2012年3月在復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院住院分娩的正常妊娠孕婦、妊娠期高血壓孕婦及子癇前期患者各25例。檢測產前產后血壓、腎功

2、能、肝功能、血尿常規(guī)、尿白蛋白、尿肌酐、血脂、超敏C反應蛋白、免疫指標、凝血功能等指標。觀察子癇前期發(fā)生的可能機制及獨立危險因素。
　　結果:
　　1、與正常妊娠組比較，子癇前期組年齡，分娩孕周，體重，BMI均有明顯差異，剖宮產、水腫及經產婦比例均較正常妊娠組高;分娩后5min、分娩后2h的收縮壓及舒張壓升高;血尿素氮、肌酐、尿酸、丙氨酸轉移酶升高;以MDRD公式計算eGFR的結果及CKD-EPI公式計算的eGFR的結果、總

3、蛋白、白蛋白、球蛋白、A/G下降;IgG、C4（P＜0.05），與正常妊娠組及妊娠期高血壓組比較，子癇前期24小時尿蛋白定量、尿微量白蛋白、尿ACR升高，差別有統計學意義(P＜0.001)。與妊娠期高血壓組比較，子癇前期組分娩孕周、總蛋白、白蛋白，差別有統計學意義（P＜0.05）。血壓、腎功能，血脂、凝血功能、免疫指標均有變化，但差別無統計學差異。
　　2、研究發(fā)現子癇前期組較正常妊娠組早產兒、低體重兒比例高，其中體重、身長差別具

4、有統計學意義(P＜0.001)，Apgar評分較正常妊娠組下降，但差別無統計學意義。
　　3、通過二分類多因素logistic回歸分析顯示孕婦年齡≤20歲或≥33歲、高血壓家族史、水腫、丙氨酸轉移酶、白蛋白水平降低、是子癇前期發(fā)生的危險因素是子癇前期發(fā)生的獨立危險因素。
　　結論:
　　腎功能中肌酐、尿素氮、尿酸、尿白蛋白、尿ACR及年齡、BMI、高血壓家族史、水腫、丙氨酸轉移酶、白蛋白、IgG、C4的變化與子癇前期的

5、發(fā)生有關系。子癇前期患者胎早產及低出生體重的概率明顯增加，母嬰不良結局的發(fā)生率明顯增加。年齡過大或過小、高血壓家族史、水腫、丙氨酸轉移酶升高、低白蛋白血癥是子癇前期發(fā)生的獨立危險因素。
　?。ǘ┳影B前期腎損傷標志物的研究
　　目的:
　　通過檢測和統計分析正常孕婦、妊娠期高血壓患者及子癇前期患者的血清和尿液相關指標、腎功能水平及腎損傷標志物水平，尋找子癇前期腎損傷的敏感因子，以期早期發(fā)現腎損傷，早期治療。
　　

6、方法:
　　選自從2011年5月-2012年3月在復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院住院分娩的正常孕婦、妊娠期高血壓孕婦及子癇前期患者各25例。分別檢測產前和產后血壓、腎功能及腎損傷標志物(血清Cystatin C、RBP、NGAL、IL-18，尿KIM-1、RBP、NGAL、IL-18)水平。
　　結果:
　　1、與正常妊娠組比較，子癇前期患者的尿RBP、血Cystatin C、血NGAL、尿NGAL、尿IL-18、尿K

7、IM-1水平顯著升高，差別有統計學意義(P＜0.05)。
　　2、與正常妊娠組比較，研究發(fā)現子癇前期患者的血RBP、血IL-18下降，但差別無統計學意義（P＞0.05）。
　　3、血RBP、尿RBP、尿NGAL與血肌酐成顯著正相關，血IL-18與血肌酐、尿ACR成顯著負相關，血Cystatin C、尿IL-18、血尿NGAL與尿ACR成顯著正相關(P＜0.05)，但相關關系均不密切(r＜0.5)。
　　4、尿RBP、尿

8、KIM-1與尿ACR成顯著正相關(P＜0.01)，且相關關系密切。血CystatinC、尿KIM-1、血NGAL、尿IL-18與血肌酐成顯著正相關(P＜0.05)，且相關關系密切(r＞0.5)。
　　5、血RBP與血肌酐、尿ACR無明顯相關性(P＞0.05)。
　　6、腎損傷標志物血Cystatin C、尿RBP、尿NGAL、尿KIM-1的最佳截斷值分別為Cystatin C＜0.935 mg/l，尿RBP＜0.600 mg

9、/l，尿NGAL＜39.889 ng/ml，尿KIM-1＜1.6432 ng/ml。靈敏度和特異度分別為80％/64％，80％/78％，70％/90％，80％/80％。
　　7、腎損傷標志物血CystatinC、尿RBP、尿NGAL、尿KIM-1兩兩聯合，靈敏度和特異度分別為:96％/49.92％(血Cystatin C與尿RBP聯合);94％/57.60％(血Cystatin C與尿NGAL聯合);96％/51.20％(血Cys

10、tatin C與尿KIM-1聯合);94％/70.20％(尿RBP與尿NGAL聯合)，96％/62.40％(尿RBP與尿KIM-1聯合)，94％/72％(尿NGAL與尿KIM-1聯合)。三個指標聯合，血Cystatin C+尿RBP+尿KIM-1聯合，靈敏度92％，特異度為88％;血Cystatin C+尿NGAL+尿KIM-1聯合，靈敏度94％，特異度為80％;血Cystatin C+尿RBP+尿NGAL聯合，靈敏度90％，特異度為7

11、2％;尿RBP+尿NGAL+尿KIM-1聯合，靈敏度94％，特異度為94％;血Cystatin C+尿NGAL+尿RBP+尿KIM-1，靈敏度100％，特異度為98.20％。
　　結論:
　　1、子癇前期腎損傷標志物血Cystatin C、血NGAL、尿RBP、尿NGAL、尿IL-18、尿KIM-1顯著升高。子癇前期患者血Cystatin C、尿KIM-1、血NGAL、尿IL-18與血肌酐關系密切，尿RBP與尿ACR關系密切

12、。
　　2、子癇前期腎損傷標志物血Cystatin C、尿RBP、尿KIM-1的靈敏度最高，KIM-1的特異度最高。子癇前期腎損傷標志物兩個指標聯合時，尿NGAL與尿KIM-1靈敏度及特異度最高;三個指標聯合時，尿RBP+尿NGAL+尿KIM-1靈敏度和特異度為最高;血Cystatin C+尿NGAL+尿RBP+尿KIM-1聯合診斷子癇前期的靈敏度100％，特異度為98.20％。
　　第二部分子癇前期腎損傷的實驗研究

13、　　目的:
　　觀察在子癇前期疾病形成過程中，足細胞凋亡是否參與腎臟損傷，探討足細胞損傷的可能機制，為子癇前期的發(fā)生尋找新的作用機制，為臨床防治子癇前期探索新的理論和實驗基礎。
　　方法:
　　通過體外培養(yǎng)條件永生化小鼠足細胞株，用正常孕婦、妊娠期高血壓患者及子癇前期患者血清干預足細胞24h，收集細胞，觀察細胞形態(tài)變化，行臺盼藍、CCK8檢測細胞活性、Annexin-Ⅴ檢測細胞凋亡情況，行Real-time PCR檢測

14、足細胞podocin及Mas受體mRNA表達情況，行Western-Blot檢測足細胞標志蛋白podocin、WT1及Mas受體蛋白含量的變化情況。
　　結果:
　　1、足細胞結構的改變:
　　足細胞經不同血清刺激干預后，Leica倒置顯微鏡觀察發(fā)現經子癇前期組刺激的足細胞體積減小，排列紊亂，胞體萎縮，足突減少縮短，二級結構消失，部分細胞脫落。
　　2、臺盼藍法檢測細胞活性:
　　不同患者血清干預足細胞后，

15、經臺盼藍染色，研究顯示，子癇前期血清干預組與正常足細胞組、正常孕婦血清干預組比較，差別有統計學意義(P＜0.001)。與妊娠期高血壓孕婦血清干預組比較，細胞活性下降，差別有統計學意義(P＜0.01)。
　　3、CCK8檢測細胞活性:
　　通過CCK-8法檢測細胞活性，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。子癇前期血清干預組與正常足細胞組比較，差別有統計學意義（P＜0.05），子癇前期與正常孕婦及妊娠期高血壓干預組比較，差別無

16、統計學意義。
　　4、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡:
　　利用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生。流式細胞儀分析顯示子癇前期患者足細胞凋亡比例最高，與正常足細胞組、正常妊娠組及妊娠期高血壓血清干預組比較，子癇前期血清干預組細胞凋亡比例明顯增加，差別有統計學意義（P＜0.001）。熒光顯微鏡下觀察子癇前期孕婦血清干預的足細胞凋亡數目最多。
　　5、Realtime及Western Blot結果

17、:
　　通過Realtime及Western Blot檢測相關mRNA及蛋白質研究發(fā)現，子癇前期血清干預組與正常未干預組比較，podocin mRNA表達下降(P＜0.05)，MasmRNA表達下降(P＜0.01)，子癇前期組與正常孕婦血清干預組比較，podocin mRNA表達無差異，Mas mRNA表達下降（P＜0.01），子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，podocin及Mas mRNA的表達均無明顯差異。子癇前期組與正常未干

18、預組及正常孕婦血清干預組比較， WT1蛋白表達下降，差異有統計學意義(P＜0.001)，與正常未干預組及正常孕婦血清干預組比較，子癇前期組podocin、Mas蛋白表達下降，差異有統計學意義(P＜0.01)，與妊娠期高血壓組比較，子癇前期組Mas、podocin、WT1蛋白表達均下降，但差異均無統計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　足細胞損傷參與到子癇前期的發(fā)病過程中，子癇前期患者血清干預足細胞可以引起足細胞的凋亡增

19、加。子癇前期患者血清可使足細胞podocin、Mas mRNA及podocin、WT1及Mas蛋白表達含量下降。足細胞存在Mas受體，子癇前期患者血清干預可使Mas表達含量下降，Mas含量的下降可能在子癇前期患者腎臟損傷中起重要作用。
　　第三部分Ang-(1-7)對子癇前期腎損傷的保護作用的實驗研究
　　目的:
　　研究不同濃度Ang-(1-7)水平對子癇前期腎臟足細胞的保護性作用，以期為臨床治療子癇前期腎損傷探索新

20、的理論和實驗基礎。
　　方法:
　　足細胞分化成熟后，以不同濃度Ang-(1-7)(10-5、10-6、10-7mol/L)加入子癇前期患者血清培養(yǎng)的足細胞中，干預培養(yǎng)24h后觀察細胞形態(tài)并收集細胞。臺盼藍、CCK8檢測細胞活性、Annexin-Ⅴ檢測細胞凋亡情況，Realtime及Western檢測相關基因及蛋白的表達。
　　結果:
　　1、臺盼藍法檢測細胞活性:
　　各組足細胞經臺盼藍染色后，與子癇前期

21、血清干預組比較，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6干預組差別活力細胞活性升高，差別有統計學意義(P＜0.01)。子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預組及子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預組與子癇前期孕婦血清干預組相比，細胞活性升高，但差別無統計學意義。
　　2、CCK8檢測細胞活性:
　　通過CCK-8法檢測細胞活性，與子癇前期血清干預組比較，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1

22、-7)10-5干預組及子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6干預組與子癇前期血清干預組差別有統計學意義(P＜0.05)。子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預組與子癇前期孕婦血清干預組相比，細胞活性升高，但差別無統計學意義。
　　3、Annexin-Ⅴ/PI檢測細胞活性:
　　利用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生。研究顯示，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預組及子癇前期孕婦血

23、清刺激+Ang-(1-7)10-6干預組與子癇前期血清干預組相比細胞活性升高，差別有統計學意義（P＜0.05）。子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預組與子癇前期孕婦血清干預組相比，細胞活性升高，但差別無統計學意義。熒光顯微鏡下觀察:子癇前期孕婦血清干預的足細胞凋亡數目最多，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預組有早期凋亡細胞;子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預組早期凋亡及晚期凋亡細胞數目

24、較子癇前期少，但比子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預組及子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6干預組凋亡細胞數目多。
　　4、Real time檢測mRNA表達情況
　　研究發(fā)現子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6較子癇前期組podocin、MasmRNA及podocin、WT1、Mas蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5