金黃色葡萄球菌腸毒素E的克隆表達(dá)和生物活性研究以及基因組DNA固定化研究.pdf

1、1989年，瑞典科學(xué)家White J提出超抗原的概念，它是一類由細(xì)菌、病毒、寄生蟲產(chǎn)生的對(duì)淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)大刺激功能的蛋白質(zhì)，由于其對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故稱為超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是目前全世界范圍內(nèi)廣泛研究的一種典型的超抗原。 與普通抗原不同，腸毒素超抗原首先以完整分子結(jié)合于抗原提呈細(xì)胞(APc)表面的II類主要組織相容性

2、復(fù)合體(MHC)的抗原結(jié)合溝槽外側(cè)，而后與T細(xì)胞表面的抗原受體分子(TCR)的Vβ區(qū)結(jié)合，形成SE-MHC-TCR三分子復(fù)合物后大量激活T細(xì)胞。由此激活的T細(xì)胞可直接殺傷表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)不表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞也可產(chǎn)生間接的殺傷效應(yīng)。 目前已發(fā)現(xiàn)的SEs約有20余種，包括：SEA～SEE、SEG～SEQ及TSST-l等。其中研究最為深入的主要包括A型金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococca

3、lenterotoxinA，SEA)、B型金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin B，SEB)、C2型金黃色萄萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)等，而對(duì)其它分型的腸毒素研究較少。E型金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxin E，SEE)作為一新型腸毒素，具有較好的熱穩(wěn)定性和較低的免疫原性，存在進(jìn)行進(jìn)一步研究的價(jià)值。

4、 為了獲得高純度的SEE蛋白，研究其抗腫瘤活性，本研究試圖通過(guò)基因工程手段大量表達(dá)重組蛋白。從天然產(chǎn)SEE的S.aureus (FRI 326)中擴(kuò)增得到see基因，克隆至E. coli中大量表達(dá)重組SEE(recombinant SEE，rSEE)，通過(guò)親和層析和陰離子交換層析得到純度高于85％的rSEE，該重組蛋白僅在N端比nsEE多兩個(gè)氨基酸殘基(亮氨酸-谷氨酸，LeuGlu)。MTT法分析rSEE對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用和體外抗

5、腫瘤效果，結(jié)果表明rSEE具有典型的超抗原活性。具超抗原活性的高純度rSEE，為進(jìn)一步研究該蛋白的抗腫瘤機(jī)制，構(gòu)建靶向抗腫瘤融合蛋白奠定了基礎(chǔ)。 本課題運(yùn)用基因工程手段獲得了純度為85％的重組腸毒素rSEE，為制備該蛋白的單克隆和多克隆抗體奠定了基礎(chǔ);MTT法結(jié)果表明rSEE具有典型的超抗原活性：低濃度下引起T細(xì)胞大量增殖，通過(guò)激活T細(xì)胞產(chǎn)生顯著的體外抗腫瘤效果，為深入研究SEE抗腫瘤原理，靶向抗腫瘤融合蛋白的構(gòu)建以及腸毒素系列

6、蛋白的平行比較研究打下物質(zhì)基礎(chǔ)。 在本次研究中，我們使用了水凝膠作為固相支持載體，選擇了合適的化學(xué)固定方法，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)人基因組DNA的固定和反復(fù)使用。首先我們將末端修飾的PCR產(chǎn)物固定到凝膠上，檢測(cè)了該法的固定效率以及熱穩(wěn)定性。通過(guò)改變反應(yīng)條件，我們嘗試用這一策略固定質(zhì)粒碎片以及基因組DNA碎片，并作為模板DNA用于隨后的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中。該法固定DNA的效率高，熱穩(wěn)定性好，固定特異性高，同時(shí)固定載體具有良好的親水性，便于隨后