AHI1蛋白與攝食行為關(guān)系的研究.pdf

1、研究目的： 1.AHI1蛋白和攝食的關(guān)系； 2.AHI1蛋白與5-HT2CR之間的關(guān)系。 材料與方法： 1.建立食欲增加的動物模型 1.1饑餓動物模型 30只8周齡雄性C57BL/6J小鼠，分三組，分別饑餓48h，24h，0h，期間可自由飲水。處死取下丘腦。Westernblotting和Real—TimePCR檢測AHI1的變化。 1.22-DG腹腔注射造成的饑餓模型 2

2、0只8周齡雄性C57BL/6J小鼠，分為2組，2-DG組2-DG(250mg/kginsaline，ip)，對照組注射生理鹽水；2-DG(2-脫氧—D—葡萄糖)是一種碳水化合物代謝選擇性阻斷劑，注射后小鼠攝食增加，4個小時內(nèi)作用明顯。監(jiān)測4個小時的攝食量，處死取下丘腦。Westernblotting和Real—TimePCR檢測AHI1的變化。 1.3STZ介導(dǎo)的1型糖尿病模型 0.1mol/l的枸櫞酸鈉和枸櫞酸1∶1，

3、調(diào)至PH值4.5，超凈臺內(nèi)過濾，配制STZ溶液。20只8周齡雄性C57BL/6J小鼠，分為2組。一組注射STZ溶液(200mg/kgip)，另一組注射枸櫞酸鈉緩沖液。一周內(nèi)測2次血糖，均超過16.7mol/l即可以認(rèn)為造模成功。處死取下丘腦。Westernblotting和Real—TimePCR檢測AHI1的變化。 1.42型糖尿病動物模型(db/db小鼠) 購買雄性成年db/db小鼠7只。對照組是性別年齡匹配的C57

4、BL/6J小鼠。取5只做westernblotting，2只做免疫組織化學(xué)。觀測小鼠下丘腦AHI1蛋白的改變，以及小鼠下丘腦各個核團AHI1蛋白量的改變。 2.降低下丘腦AHI1的表達(dá)觀察對體重攝食的影響 40只8周齡雄性C57BL/6J小鼠用siRNA沉默下丘腦攝食相關(guān)核團VMH等的AHI1表達(dá)來改變AHI1的含量，監(jiān)測一個月小鼠的攝食量、體重改變。 方法：8％水合氯醛100-150mg/kg體重進行動物麻醉，

5、按TheMouseBrain小鼠圖譜(2001，1997byACADEMICPRESS)前后-1.1mm，旁開±0.5mm，深度—5.5mm，腺病毒包裹的AHI1特異性shRNA(量1011pfu/ml)，溶于PBS中，每側(cè)注射1μL。用腦立體定位儀及微量進樣器注射入雙側(cè)下丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)，10min注射完，留針2min。對照組注射腺病毒包裹的scramble—shRNA(空載體)。 3.AHI1蛋白和5-HT2cR關(guān)系的研究

6、 3.1免疫熒光組織化學(xué)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測共定位關(guān)系 8周齡雄性C57BL/6J小鼠心臟灌注處死，取腦組織，4％多聚甲醛浸泡充分后固定。固定結(jié)束后用30％蔗糖滲透，OCT冰凍包埋，制備8μm厚度的冰凍切片。用PBS搖動清洗切片10min。樣品用正常胎牛血清(PBS+10％FBS+0.2％Triton)室溫封閉2小時，與適當(dāng)比例稀釋的一抗(抗AHI11:200和抗5-HT2cR1:8)于4℃孵育過夜。次日用磷酸鹽緩沖液(P

7、BS+1％BSA+5％Tween)漂洗4次，每次10分鐘，然后加適當(dāng)比例稀釋的熒光標(biāo)記二抗(先敷donkeyantiGoat488，室溫孵育1小時，再次充分漂沈。然后敷Goatantirabbit594，室溫孵育1小時，再次充分漂洗)。最后用DAPI染色并漂洗后，80％甘油—磷酸鹽緩沖液封片。培養(yǎng)小鼠下丘腦神經(jīng)元至14Div(dayinvitro)，4％PFM—PB室溫固定30min，AbAHI11:300andAb5HT2cR1:8共

8、染。步驟如上。在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種分子的定位。 3.2免疫共沉淀檢測AHI1蛋白和5-HT2cR的相互結(jié)合關(guān)系 凍干的蛋白A—瓊脂糖珠(proteinA—sepharosebeads)在室溫下加bufferA溶脹30min或更長時間，切忌用任何攪拌器攪拌，每克干粉可溶到3-4ml水合凝膠。取適量蛋白A—beads用RIPA洗2次，并重懸于RIPA中備用；預(yù)冷離心機。取實驗老鼠，斷頭后2min內(nèi)取完整腦組織。在研磨

9、器里加入RIPAbuffer進行勻漿(或簡短超聲裂解)。組織勻漿液在16000rpm，4℃，離心15min(S1)。用BCA試劑盒測S1樣品濃度，并調(diào)節(jié)終濃度為1mg/ml。依照每毫克S1蛋白加80μl50％beads量，混合S1和相應(yīng)的50％蛋白A—sepharosebeads(可使用回收beads)，然后，在4℃孵育1h，以減少非特異性結(jié)合。沉淀后，除去beads，然后加入AHI1(Cterminal)抗體到上清液(S2)，4℃反復(fù)

10、顛倒混勻，過夜?；旌蟂2和新的50％蛋白A—sepharosebeads，室溫孵育2h，沉淀免疫復(fù)合物。離心，收集免疫沉淀，并用RIPAbuffer洗3次(選用300mMNaCl作為漂洗溶液)。免疫沉淀物和S2進行westernblotting分析SHT2cR和AHI1蛋白。 4.統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析、灰度分析、數(shù)據(jù)制圖采用molecularDynamics，Graphadsoftware，SPSS11.0。實

11、驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布者用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=有效樣本例數(shù))表示。首先對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性、方差齊性檢驗然后采用隨機化配對資料均數(shù)的t檢驗，經(jīng)正態(tài)性檢驗三組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著(*)，P<0.01認(rèn)為差異較顯著(**)。 實驗結(jié)果： 1.食欲增加模型 1.1饑餓動物模型 饑餓組和正常組小鼠相比，westernblotting顯示AHI1蛋白在饑餓后增加(對照組VS饑餓24h組P<0

12、.05：對照組VS饑餓48h組P<0.05；饑餓24h組VS饑餓48h組P>0.05)。Real—TimePCR顯示饑餓后AHI1mRNA增加約50％和80％。 1.22-DG腹腔注射造成的饑餓模型 2-DG注射4h內(nèi)藥物組小鼠比對照組小鼠攝食增加(P<0.05)，westernblotting顯示AHI1蛋白增加(P<0.01)，Real—TimePCR顯示下丘腦的AHI1mRNA增加約87％。 1.3STZ介

13、導(dǎo)的1型糖尿病模型 正常小鼠組與STZ造成的1型糖尿病小鼠組比較westernblotting顯示AHI1蛋白增加(P<0.01)，Real—TimePCR顯示AHI1mRNA增加約60％。 1.42型糖尿病動物模型(db/db小鼠) 免疫組織化學(xué)和westenblotting顯示db/db小鼠組與正常小鼠組比較下丘腦的AHI1蛋白增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 2.降低下丘腦AHI1的表達(dá)觀

14、察對體重攝食的影響 應(yīng)用RNA干擾降低小鼠下丘腦AHI1的表達(dá)后，小鼠在RNA干擾后的兩周內(nèi)攝食下降明顯(D4，D9-D13P<0.05；D5-D8P<0.01；D1-D3，D14-D30P>0.05)，體重也有明顯下降(D3，D9-D12P<0.05；D4-D8P<0.01；D1-D2，D13-D30P>0.05)。 3.AHI1蛋白和5-HT2cR的共定位和相互結(jié)合關(guān)系研究 3.1小鼠下丘腦神經(jīng)元以及下丘腦組

15、織免疫組織化學(xué)熒光結(jié)果 完整的神經(jīng)元中AHI1蛋白和5HT2cR主要分布在胞體核周區(qū)，突觸內(nèi)有少量分布(特別是在突觸分支處)。神經(jīng)元胞體內(nèi)AHI1蛋白成“stigmoidbody”狀分布，5HT2cR的分布與這些stigmoidbodies有部分重疊?？梢娚Ⅻc狀共染。 小鼠腦組織免疫組織化學(xué)熒光顯示：ARC、LH、VMH內(nèi)均可看到AHI1蛋白和SHT2cR散點狀共染。 3.2免疫共沉淀檢測AHI1蛋白和5-HT2