重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞線粒體形態(tài)變化所致細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、目的:研究重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)對(duì)新生兒窒息后血清誘導(dǎo)人近曲腎小管上皮細(xì)胞(human renalproximal tublar cells,HK-2)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 方法:(1)以人人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對(duì)象。(2)以新生兒重度窒息(Apgar評(píng)分小于4分)后24h血清(20％體積分?jǐn)?shù))作為攻擊因素。(3)先將實(shí)驗(yàn)分為

2、對(duì)照組和窒息組,探討窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的損傷是否有線粒體形態(tài)變化。再將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、窒息組和rhEPO組,探討rhEPO對(duì)窒息后血清導(dǎo)致HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。(4)檢測(cè)指標(biāo):倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,Cell CountingKit-8(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞活力變化,免疫組織化學(xué)法觀察與線粒體形態(tài)變化相關(guān)的蛋白:動(dòng)力相關(guān)蛋白1(Dynamin related protein1,DRP1)和視神經(jīng)萎

3、縮癥蛋白(optic atrophy,OPA1)的表達(dá),透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)變化。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)值以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±S表示,分別進(jìn)行配對(duì) t檢驗(yàn)和單因素方差分析組間LSD檢驗(yàn),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果:(1)倒置相差顯微鏡下觀察HK-2形態(tài)學(xué)變化:對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好,透明度大,折光性強(qiáng),呈鋪路石樣,為扁平的多角形,分裂相多,細(xì)胞排列緊密,連接成片,數(shù)量多,胞質(zhì)

4、中顆粒少。窒息組細(xì)胞生長緩慢,細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組明顯減少,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,由典型的扁平多角形細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形,折光性減弱,輪廓增強(qiáng),胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡,脂滴,顆粒樣物質(zhì),細(xì)胞間空隙加大,連接松散,細(xì)胞間可見較多細(xì)胞碎片。rhEPO組:細(xì)胞損傷狀況明顯得到改善,較窒息組細(xì)胞生長狀況明顯好轉(zhuǎn),形態(tài)明顯變好。(2)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力變化:與對(duì)照組細(xì)胞活力(A值)(0.74±0.08)相比,窒息組細(xì)胞活力(0.41±0.06)明顯降

5、低,rhEPO組細(xì)胞活力(0.60±0.08)與窒息組和正常組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(3)免疫組織化學(xué)法測(cè)定DRP1表達(dá):與對(duì)照組(0.24±0.03)相比,窒息組細(xì)胞 DRP1表達(dá)光密度值(0.51±0.03)顯著升高,rhEPO組(0.38±0.03)較窒息組有所恢復(fù),但未恢復(fù)至對(duì)照組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(4)免疫組織化學(xué)法測(cè)定 OPA1表達(dá):與對(duì)照組(0.47±0.02)相比,窒息組細(xì)胞 O

6、PA1表達(dá)光密度值(0.21±0.02)顯著降低,rhEPO組(0.36±0.02)較窒息組有所恢復(fù),但未恢復(fù)至對(duì)照組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(5)投射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察線粒體形態(tài)變化:對(duì)照組和rhEPO組線粒體結(jié)構(gòu)完整,基質(zhì)分布均勻,可見線粒體嵴；窒息組線粒體出現(xiàn)腫脹,空泡變性,基質(zhì)減少,部分嵴消失。
　　 結(jié)論:新生兒窒息后血清可誘導(dǎo) H