miR-137增強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)地塞米松的敏感性并提高其自噬活性的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述:
　　第一部分 miR-137作用于MITF下調(diào)AKT磷酸化增強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的地塞米松敏感性
　　目的：本實(shí)驗(yàn)以人多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者及非MM患者的骨髓單個(gè)核CD138+細(xì)胞，人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226和U266細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察miR-137在MM細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及其對(duì)MM細(xì)胞地塞米松敏感性的影響，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。
　　方法：用磁珠分選法分選MM患者及非MM患者的

2、骨髓單個(gè)核CD138+細(xì)胞；Taqman real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-137的表達(dá)情況；雙熒光素酶報(bào)告基因法對(duì)miR-137的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證；慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染MITF-shRNA以及過表達(dá)miR-137，MITF；Real-time PCR法檢測(cè)MITF，c-MET，P53的mRNA表達(dá)變化；Western blot或免疫熒光法檢測(cè)MITF，c-MET，AKT，P53，p-AKT及其下游磷酸化蛋白的表達(dá)；MTT法和流式細(xì)

3、胞術(shù)凋亡檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染前后MM細(xì)胞的地塞米松敏感性。
　　結(jié)果：miR-137在RPMI8226和U266細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到表達(dá)，在MM患者骨髓單個(gè)核CD138+細(xì)胞的表達(dá)顯著低于非MM患者骨髓單個(gè)核CD138+細(xì)胞；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示MITF是miR-137的一個(gè)靶點(diǎn)；與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體相比，轉(zhuǎn)染miR-137或MITF-shRNA后，MITF，c-MET，p-AKT及其下游磷酸化底物蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，AKT的表達(dá)無明顯變化，P5

4、3表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)，地塞米松對(duì)MM細(xì)胞的36h抑制率及其誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡率均明顯上調(diào)；在轉(zhuǎn)染了miR-137的MM細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MITF，可以逆轉(zhuǎn)上述變化。
　　結(jié)論：miR-137可以引起MM細(xì)胞內(nèi)MITF及其下游c-MET的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而使AKT 的磷酸化水平下調(diào)，從而提高了MM細(xì)胞對(duì)地塞米松的敏感性。
　　第二部分 miR-137作用于 MITF下調(diào) AKT磷酸化提高多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的自噬活

5、性
　　目的：本實(shí)驗(yàn)以人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察miR-137在RPMI8226細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及其對(duì)RPMI8226細(xì)胞自噬的影響，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。
　　方法：用慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染MITF-shRNA以及過表達(dá)miR-137，MITF；Western blot法檢測(cè)MITF，c-MET，AKT，p-AKT，p-mTOR，p-Beclin1，LC3 II的表達(dá)；免疫共沉淀（co-IP）法檢測(cè)p-

6、Beclin1與14-3-3蛋白和Vimentin蛋白的結(jié)合。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-137或MITF-shRNA后，AKT的表達(dá)無明顯變化，MITF，c-MET， p-AKT，p-mTOR，p-Beclin1表達(dá)明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-137或MITF-shRNA后， LC3 II在基礎(chǔ)情況下有少量增多，在饑餓誘導(dǎo)時(shí)顯著增多；在轉(zhuǎn)染了miR-137的MM細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MITF，可以逆轉(zhuǎn)miR-137的上述生物學(xué)效應(yīng)。
　　結(jié)論