鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽CLP-19抑制LPS的免疫應(yīng)答作用研究.pdf

1、目的：
　　膿毒癥(sepsis)是一種臨床上常見的危重病癥,具有發(fā)病率高，死亡率高的特點(diǎn)。存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜主要成分之一的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS),也稱內(nèi)毒素(endotoxin),是膿毒癥發(fā)生的主要始發(fā)因子，從源頭上阻止膿毒癥的發(fā)生即封閉LPS觸發(fā)的炎癥瀑布反應(yīng)是對(duì)抗膿毒癥的有效手段之一。課題組在前期研究中，針對(duì)與LPS具有高親和力的鱟抗內(nèi)毒素因子(limulus anti-lipopol

2、ysaccharide factor，LALF)開展廣泛研究，以LALF為模板并采用計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)并合成數(shù)十條多肽，并優(yōu)選出一條中和LPS能力強(qiáng)，安全性高的19個(gè)氨基酸殘基的環(huán)狀鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽CLP-19。在前期研究過程中發(fā)現(xiàn)CLP-19提前20h給予對(duì)大腸埃希菌急性腹膜炎小鼠具有較好的保護(hù)作用，可顯著提高其生存率；且在細(xì)胞水平仍能抑制可LPS結(jié)構(gòu)完全不同的IL-1β刺激的RAW264.7細(xì)胞TNF-α水平升高，提示CLP-19可

3、能具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用并通過該調(diào)節(jié)作用抑制LPS的免疫應(yīng)答。
　　本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過觀察CLP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)PBMC的MAPK信號(hào)通路和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用；與單核/巨噬細(xì)胞結(jié)合，并觀察CLP-19預(yù)處理對(duì)細(xì)胞炎癥因子和趨化因子表達(dá)的影響及對(duì)LPS所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的作用，在體研究CLP-19預(yù)保護(hù)動(dòng)物對(duì)LPS所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用；以初步闡明CLP-19抑制LPS免疫應(yīng)答的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第

4、一部分：CLP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞炎癥信號(hào)通路的影響
　　1. CLP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞MAPK信號(hào)通路磷酸化水平的影響：通過觀察LPS作用于PBMC細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)(0min,10min,20min,30min,60min)MAPK通路(p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38)磷酸化水平，以選擇合適觀察時(shí)間點(diǎn)；并觀察不同濃度(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)的CLP-19對(duì)LPS所

5、誘導(dǎo)MAPK通路磷酸化水平影響，以相同濃度多粘菌素B(PMB)為對(duì)照。
　　2. CLP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞細(xì)胞因子、趨化因子mRNA表達(dá)水平的影響：以不同濃度組(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)的CLP-19及LPS(100ng/ml)作用PBMC，4h行RT-PCR，觀察不同細(xì)胞因子MCP-1、TNF-α、IL-10、IL-6、ICAM-1的變化情況。
　　第二部分：CLP-19對(duì)LPS刺激單

6、核/巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答的影響一、CLP-19對(duì)LPS與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合的影響
　　1.流式細(xì)胞技術(shù)觀察CLP-19對(duì)LPS與RAW264.7結(jié)合的影響：在不含血清條件下，將羅丹明標(biāo)記的CLP-19(R-CLP-19，10μg/ml)和FITC-LPS(1μg/ml)先后或同時(shí)與細(xì)胞孵育，流式觀察CLP-19或LPS與細(xì)胞結(jié)合情況。并以有血清的存在下，觀察R-CLP-19與FITC-LPS與細(xì)胞結(jié)合情況為對(duì)照。
　　2

7、.激光共聚焦技術(shù)觀察CLP-19對(duì)LPS與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合的影響在無(wú)血清的條件下，觀察不同濃度(10μg/ml、100μg/ml)的CLP-19對(duì)FITC-LPS(1μg/ml)與RAW264.7的結(jié)合的影響，并以有血清存在作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　二、CLP-19抑制LPS所誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞免疫應(yīng)答作用研究
　　1. RT-PCR觀察CLP-19單獨(dú)作用RAW264.7細(xì)胞因子、趨化因子mRNA水平的影響考察固

8、定濃度(50μg/ml)的CLP-19作用于RAW264.7細(xì)胞后0.5h、1h、2.5h、5h、10h、20h的不同時(shí)間，及不同濃度(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的CLP-19作用于RAW264.7細(xì)胞20h，觀察細(xì)胞TNF-α、IL-10、MCP-1、ICAM1的mRNA水平的變化情況。另對(duì)(50μg/ml)的CLP-19的CLP-19預(yù)處理細(xì)胞5h、10h、20h后，清洗細(xì)胞再

9、以LPS刺激，4h后提取細(xì)胞RNA，觀察上述細(xì)胞因子的變化，以CLP-19與LPS預(yù)混組為對(duì)照。
　　2. Real-Time PCR分析CLP-19對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子、趨化因子mRNA水平的影響：考察不同濃度(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的CLP-19單獨(dú)作用于或與LPS(100ng/ml)共同作用于RAW264.7，4h后提取細(xì)胞RNA，觀察TNF-α

10、、IL-1、MCP-10的mRNA水平的變化情況，并以同劑量組的cLALF為對(duì)照。
　　3. ELISA觀察CLP-19對(duì)RAW264.7細(xì)胞MCP-1釋放的影響：通過觀察相同劑量(100μg/ml)的CLP-19和cLALF及LPS作用于RAW264.7細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、6 h、12 h、24 h)測(cè)定MCP-1的釋放影響；并在此基礎(chǔ)上，選擇對(duì)MCP-1調(diào)節(jié)能力較好的CLP-19在不同濃度下(25μg/ml,50μg/

11、ml,100μg/ml)對(duì)有無(wú)LPS存在下釋放MCP-1的影響。
　　4. Transwell法觀察CLP-19 RAW264.7趨化作用的影響：趨化小室法觀察不同濃度的CLP-19(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)對(duì)RAW264.7定向移動(dòng)能力的影響。
　　第三部分：CLP-19預(yù)保護(hù)小鼠對(duì)LPS刺激的免疫應(yīng)答作用初探
　　相同劑量(2mg/kg)的CLP-19或cLALF分別于提前20 h、10 h

12、、5 h作用于小鼠，再給予亞致死劑量LPS，分別于LPS刺激前(0 h點(diǎn))及刺激后4 h分離小鼠血清，ELISA法測(cè)定MCP-1、TNF-α及IL-10的變化情況，并以LPS與CLP-19或cLALF混合后同時(shí)給予為對(duì)照。組織病理學(xué)觀察小鼠重要臟器(肝、肺、腎、小腸、心)的變化情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分：CLP-19抑制LPS對(duì)PBMC細(xì)胞炎癥信號(hào)通路及細(xì)胞因子的作用研究1. CLP-19可顯著抑制LPS MAPK信號(hào)

13、通路磷酸化水平：經(jīng)Western bloting研究
　　發(fā)現(xiàn)，LPS作用于PBMC細(xì)胞30min后MAPK通路(p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38)磷酸化水平呈顯著增加(P＜0.01)；所考察的CLP-19各組(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)均可顯著抑制LPS致MAPK通路激活，且呈劑量依賴效應(yīng)，該作用與多粘菌素B(PMB)陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)。
　　2. CLP-19可顯著抑制LPS致細(xì)胞因子、趨

14、化因子mRNA水平：CLP-19對(duì)LPS作用PBMC的細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10、IL-6)、趨化因子(MCP-1)、黏附因子(ICAM1) mRNA水平呈顯著抑制作用(P＜0.01)，且該作用呈顯劑量依賴關(guān)系(P＜0.01)。
　　第二部分：CLP-19對(duì)LPS刺激單核/巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用研究
　　1. CLP-19對(duì)LPS與RAW264.7結(jié)合的影響：流式細(xì)胞技術(shù)和激光共聚焦研究結(jié)果表明，在有血清存在下，LPS

15、或CLP-19單獨(dú)或兩者同時(shí)存在下均能與細(xì)胞結(jié)合；而在不含血清條件下，LPS不能直接與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合，但CLP-19可與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合，且能介導(dǎo)LPS與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合；且無(wú)論CLP-19先加入還是LPS先加入，兩者在同時(shí)存在下均能與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合。
　　2. CLP-19對(duì)RAW264.7細(xì)胞因子、趨化因子mRNA水平的影響CLP-19單獨(dú)作用于RAW264.7細(xì)胞研究結(jié)果顯示，CLP-19

16、對(duì)MCP-1的mRNA調(diào)節(jié)呈顯著的時(shí)間依賴性和劑量依賴性，高劑量的CLP-19可上調(diào)ICAM-1、TNF-α和IL-10的mRNA水平。以CLP-19預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞的不同時(shí)間（5h、10h、20h），其均可顯著抑制LPS所刺激的炎癥因子上調(diào)，各預(yù)處理組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3. CLP-19對(duì)RAW264.7細(xì)胞MCP-1釋放的影響：CLP-19和cLALF單獨(dú)作用下可顯著上調(diào)MCP-1水平，但該作用顯著低于LPS的誘

17、導(dǎo)分泌能力，cLALF誘導(dǎo)MCP-1產(chǎn)生能力也顯著低于CLP-19的誘導(dǎo)能力(P＜0.01)；CLP-19在LPS存在下，一方面CLP-19可中和LPS，抑制其誘導(dǎo)水平，另一方面，游離的CLP-19或LPS也可作用于細(xì)胞，誘導(dǎo)MCP-1產(chǎn)生，該作用呈顯著劑量依賴效應(yīng)。
　　4. CLP-19對(duì)RAW264.7細(xì)胞有一定的趨化作用：趨化小室法研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的CLP-19(10μg/ml、100μg/ml)對(duì)RAW264.7有一定

18、的趨化作用，誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生定向移動(dòng)，但該作用低于陽(yáng)性對(duì)照血清組。
　　第三部分：CLP-19預(yù)保護(hù)小鼠對(duì)LPS免疫應(yīng)答作用初探
　　1. CLP-19或cLALF預(yù)處理小鼠無(wú)明顯致炎作用提前20 h、10 h或5 h給予的CLP-19或cLALF小鼠各組間TNF-α、IL-10顯著抑制，但提前5h給藥后小鼠TNF-α有顯著升高(P＜0.01)，CLP-19、cLALF各組間20 h、10 h、5 h均可顯著上調(diào)

19、MCP-1的表達(dá)，在相同時(shí)間點(diǎn)CLP-19調(diào)節(jié)MCP-1能力顯著強(qiáng)于cLALF。
　　2. CLP-19或cLALF預(yù)處理小鼠對(duì)LPS致炎作用的調(diào)節(jié)提前20 h、10 h、5h或同時(shí)給予CLP-19或cLALF的各組間均可顯著下調(diào)TNF-α、IL-10和MCP-1的水平，以同時(shí)給藥作用最為顯著，其次為提前20h給予組；
　　3. CLP-19與cLALF對(duì)小鼠肝臟有輕微病理改變外，其余臟器無(wú)病理改變，LPS組小鼠肺、肝、腎均

20、出現(xiàn)炎癥性病理改變，尤以肺臟和肝臟明顯，提前給予CLP-19或cLALF組各臟器病變程度顯著減輕。
　　結(jié)論：
　　1.鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽CLP-19可顯著抑制PBMC細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；2. CLP-19可抑制LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫應(yīng)答：
　　(1) CLP-19可與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合且能介導(dǎo)LPS與細(xì)胞結(jié)合；
　　(2) CLP-19可顯著上調(diào)RAW264.7趨化因子MCP-1 m