胃旁路術(shù)后脂聯(lián)素對(duì)2型糖尿病大鼠血糖控制及對(duì)胰島凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：2型糖尿病(T2DM)是包括遺傳及環(huán)境等多種因素相互作用的結(jié)果。傳統(tǒng)的藥物及胰島素治療不能延緩糖尿病并發(fā)癥出現(xiàn)的時(shí)間及疾病的進(jìn)程。
　　 Walter首次發(fā)現(xiàn)減肥手術(shù)可以治療糖尿病這一現(xiàn)象。據(jù)Wickremesekera報(bào)道T2DM血糖可在術(shù)后幾天至幾周內(nèi)緩解。RYGB是一種減肥手術(shù),其中繞過(guò)了80-90％的胃體,患者將減少60-90％額外的體重和獲得良好的血糖控制,這種作用可以維持15年以上。
　　 既往認(rèn)為胃容

2、積減少及營(yíng)養(yǎng)吸收不良引起體重減輕對(duì)血糖控制起到重要作用,但是營(yíng)養(yǎng)不良的指標(biāo)如白蛋白、前白蛋白糞內(nèi)脂類(lèi)并未增加。一些研究表明在體重有效減輕之前T2DM已得到有效控制。目前認(rèn)為體重減輕和血糖控制與體內(nèi)內(nèi)分泌激素變化有關(guān),RYGB術(shù)后觀察到胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、肽YY(PYY)、脂聯(lián)素、ghrelin等均升高。然而,該手術(shù)降糖及控制體重的確切機(jī)制尚未完全清楚。
　　 脂聯(lián)素由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生和分泌,具有減輕胰島素抵抗、抗動(dòng)脈粥

3、樣硬化、抗炎等多種生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和受體2(AdipoR2)均在胰島細(xì)胞中表達(dá),并以AdipoR1表達(dá)為主。研究表明在中心性肥胖及T2DM中脂聯(lián)素水平下降。脂聯(lián)素水平與HOMA-IR值、總膽固醇水平、低密度脂蛋白、甘油三酯、血壓、BMI成負(fù)相關(guān)。脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗緩解和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。脂聯(lián)素基因敲除小鼠表現(xiàn)出高血糖,注射脂聯(lián)素后可消除高血糖并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 RYGB在控制

4、血糖機(jī)制方面沒(méi)有完全闡述清楚。本研究目的在于觀測(cè)RYGB是否具有減少胰島細(xì)胞凋亡的作用及脂聯(lián)素在RYGB手術(shù)中所起的降糖作用。目前脂聯(lián)素是否影響胰島素分泌及對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島B細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用存在爭(zhēng)議,RIN-m5f細(xì)胞系是能夠分泌胰島素的小鼠胰島細(xì)胞系,本研究應(yīng)用RIN-m5f細(xì)胞系觀察脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)是否具有促進(jìn)胰島素分泌作用,對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否有保護(hù)作用,并解釋其分子機(jī)制。
　　 材料及方法：

5、　　 一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 (一)20只10周齡雄性Goto-Kakizaki(GK)大鼠(一種自發(fā)糖尿病鼠),隨機(jī)分到RYGB組(10)和GK組(10)。10周齡Wistar大鼠分配到WS組(10)。飼養(yǎng)環(huán)境室溫26±1℃,相對(duì)濕度45％,自然光照明,術(shù)前至少10天單籠飼養(yǎng)。
　　 (二)RYGB組動(dòng)物行胃旁路手術(shù),保留賁門(mén)附近約20％胃體,保留迷走神經(jīng),距Treitz韌帶10cm斷空腸,遠(yuǎn)端上提與殘胃吻合,距吻合口1

6、0cm行空腸近端與空腸端側(cè)吻合。GK組及WS組大鼠為假手術(shù)組,胃前壁切開(kāi)7mm切口,并原位縫合?？刂剖中g(shù)時(shí)間與RYGB組相同。
　　 (三)檢測(cè)
　　 1、術(shù)前3天、術(shù)后7、14、21、28天測(cè)定動(dòng)物體重及每100克體重?cái)z食量。
　　 2、術(shù)前、術(shù)后30天各測(cè)定空腹血糖(FBS)1次。
　　 3、術(shù)前2天和術(shù)后30天各測(cè)定一次OGTT。大鼠禁食12 h,一次性灌胃給予50％葡萄糖(2 g/Kg體重)。尾靜

7、脈穿刺法采血,血糖儀法測(cè)定血糖值。采血時(shí)間點(diǎn)分別為0、30、60、90、120 min。用血糖曲線下面積(AUC)評(píng)價(jià)OGTT。
　　 4、術(shù)前2天和術(shù)后30天分別檢測(cè)一次餐前及餐后胰島素、C-肽及脂聯(lián)素水平(ELISA)。
　　 二、細(xì)胞部分
　　 (一)Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將大鼠胰島細(xì)胞系RIN-m5f分為normal、glucose、A0.2、A2、A20組。分別于A0.2

8、、A2、A20組分別加入gAd至0.2、2、20μg/ml作用細(xì)胞,各組培養(yǎng)12h后,于glucose、A0.2、A2、A20組分別給予高糖至33.3mM,培養(yǎng)12h后應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 (二)gAd對(duì)RIN.m5f細(xì)胞胰島素分泌的測(cè)定
　　 1、根據(jù)培養(yǎng)基中g(shù)Ad濃度不同,分為A0、A0.2、A2、A20μg/ml組,經(jīng)gAd作用12h后ELISA法檢測(cè)胰島素水平。
　

9、　 2、將gAd濃度調(diào)整為2μg/ml,分別于培養(yǎng)后2、6、12、24h后ELISA法檢測(cè)胰島素水平。
　　 (三)gAd對(duì)胰島素分泌影響的分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)設(shè)為正常組(C)及gAd濃度2gg/ml組(A)。將細(xì)胞培養(yǎng)12h,收集細(xì)胞,免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)胰島素、AMPK及AdipoR1及Real-timequantitative PCR測(cè)定上述指標(biāo)。
　　 (四)AdipoR1 siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)

10、胰島素表達(dá)的影響將細(xì)胞經(jīng)siRNA AdipoR1轉(zhuǎn)染后,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及免疫蛋白印跡(Westernblot)法檢測(cè)胰島素。
　　 (五)gAd對(duì)高糖誘導(dǎo)的RIN-m5f細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)設(shè)為三組:正常組(C)、高糖組(G)及gAd保護(hù)組(A)組。A組加gAd調(diào)整濃度至2μg/ml,共同培養(yǎng)12h后,在G、A組加入葡萄糖至濃度為33.3mM,12h后收集細(xì)胞W-B及Real-time quantitative PCR法檢測(cè)P

11、KC、BAD、Bcl-xL及AdipoR1。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用(x)+SD表示,用SPSS11.5分析軟件處理,并應(yīng)用單因素方差分析、Studentt-test及Tukey's test處理數(shù)據(jù)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、手術(shù)結(jié)果
　　 RYGB組大鼠術(shù)后2只吻合口梗阻死亡,GK組術(shù)后因切口感染死亡1只,WS假手術(shù)組無(wú)死亡。
　　 二、術(shù)后大鼠體重變化術(shù)前R

12、YGB、GK及WS組組間體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后1周時(shí),術(shù)后各組大鼠體重均有不同程度降低,術(shù)后3周時(shí)體重有所增加,并維持在該水平。RYGB組降低明顯與其他兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。GK組術(shù)后28天時(shí)體重比WS組降低明顯,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、術(shù)后攝食率的變化術(shù)前各組間攝食率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后RYGB組攝食率明顯下降,21天時(shí)有上升趨勢(shì),但仍低于其他兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

13、 四、術(shù)前、術(shù)后空腹血糖(FBS)的變化術(shù)前RYGB組、GK組FBS水平明顯高于WS組,差異具有顯著性(P均＜0.01)。術(shù)后30天時(shí)RYBG組FBS值已基本降至正常范圍,并與WS組無(wú)顯著性差異。
　　 五、術(shù)后口服葡萄糖耐量的變化術(shù)前RYGB組、GK組OGTT曲線下面積(area under curve,AUC)值顯著大于對(duì)照組(P均＜0.05)。術(shù)后30天時(shí),RYGB組AUC值顯著降低,與WS組無(wú)差異顯著性。
　　

14、六、術(shù)后血漿胰島素的變化術(shù)前RYGB組、GK組大鼠基礎(chǔ)餐前血漿胰島素水平并不低于正常對(duì)照組(P＞0.05)。而餐后RYGB組及GK組大鼠血漿胰島素明顯低于WS組(P＜0.01)。術(shù)后各組基礎(chǔ)血漿胰島素水平較術(shù)前無(wú)明顯下降變化,各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后RYGB組餐后胰島素與GK組相比有明顯升高。
　　 七、RYGB手術(shù)對(duì)胰島素抵抗的影響術(shù)前RYGB組、GK組HOMA-IR值均顯著高于WS組,表明術(shù)前GK大鼠存在明顯的胰島素抵抗,差

15、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。術(shù)后RYGB組HOMA-IR值明顯降低,并與WS組HOMA-IR值無(wú)明顯差異(P＞0.05),而該兩組HOMA-IR值明顯低于WS組,有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 八、血漿C-肽測(cè)定術(shù)前RYGB組、GK組C-肽值顯著低于對(duì)照組(P均＜0.01)。術(shù)后30天時(shí),RYGB組C-肽值顯著高于GK組(P＜0.01)。
　　 九、血清脂聯(lián)素水平測(cè)定RYGB組及GK組脂聯(lián)素水平顯著低于對(duì)照組

16、。術(shù)后30天時(shí),RYGB組脂聯(lián)素升高至正常水平,顯著高于GK組(P＜0.01)。
　　 十、術(shù)后胰島TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)術(shù)后30天時(shí),RYGB組(2.85±0.26％)及WS組(2.92±0.21％)凋亡指數(shù)顯著低于GK組(16.38±0.45％),GK組可以看到更多的凋亡細(xì)胞。
　　 十一、透射電鏡結(jié)果GK組可以觀察到更多典型的凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核不規(guī)則,染色質(zhì)凝集、邊聚。
　　 十二、Annexin V-FIT

17、C/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)glucose組凋亡指數(shù)(16.85±1.40％)明顯高于其他各組(P＜0.01)。脂聯(lián)素對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用,并隨著濃度增加保護(hù)作用增強(qiáng)。
　　 十三、gAd對(duì)RIN-m5f細(xì)胞胰島素分泌的影響隨著各組gAd濃度的增加,胰島素分泌量有所增加,各組差異有顯著性。當(dāng)gAd濃度為2μg/L,隨時(shí)間的延長(zhǎng),胰島素分泌量增加,差異有顯著性,12h時(shí)達(dá)到高峰。
　　 十四、gAd對(duì)RIN-m5f細(xì)胞胰

18、島素分泌影響分子機(jī)制gAd作用后,Real-time quantitative PCR及W-B結(jié)果顯示:A組AdipoR1表達(dá)上調(diào),差異有顯著性;胰島素表達(dá)增加,差異有顯著性(P＜0.01),AMPK表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 十五、siRNAA干擾AdipoR1后對(duì)胰島素表達(dá)的影響AdipoR1 siRNA轉(zhuǎn)染后,AdipoR1表達(dá)量下降80％(P＜0.01)。胰島素表達(dá)下降為0.45±0.09(P＜0.01)。<

19、br>　　 十六、gAd對(duì)高糖誘導(dǎo)的RIN-m5f細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用Real-time quantitative PCR及W-B結(jié)果顯示A組AdipoR1表達(dá)量較其它兩組升高。PKC在A組比C組表達(dá)量增加,而G組比A、C兩組表達(dá)量均降低。A組BAD比C、G組表達(dá)量下降,C組表達(dá)量較A組增加。Bcl-xL在A組比C組表達(dá)量增加,G組比A、C兩組表達(dá)量均降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、RYGB具有治療T2DM作用。

20、　　 2、RYGB術(shù)后餐后胰島素升高是良好控制血糖的原因之一。
　　 3、RYGB術(shù)后可以通過(guò)減少凋亡對(duì)T2DM胰島細(xì)胞起保護(hù)作用。
　　 4、RYGB術(shù)后升高的脂聯(lián)素可能對(duì)控制血糖及減少胰島細(xì)胞凋亡發(fā)揮重作用。
　　 5、gAd可以通過(guò)與AdipoR1結(jié)合引起胰島素分泌,并有時(shí)間及劑量依賴(lài)關(guān)系,該過(guò)程與AMPK表達(dá)無(wú)關(guān)。
　　 6、gAd對(duì)高糖引起的胰島細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用,并有劑量依賴(lài)關(guān)系。