RNAi抑制NF-ΚB-p65基因的表達(dá)及對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞生物活性的影響.pdf

1、[目的]
　　 NF-κB/p65是一類重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，它能調(diào)控許多下游基因的表達(dá)，涉及到細(xì)胞的黏附、浸潤、轉(zhuǎn)移等方面。多項(xiàng)研究表明，NF-κB/p65及其家族成員在許多人類腫瘤中都顯示高表達(dá)。本研究擬利用RNA干擾技術(shù)，以NF-κB/p65的mRNA為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建NF-κB/p65 shRNA的真核表達(dá)載體。特異沉默NF-κB/p65的基因表達(dá)，探討沉默NF-κB/p65基因?qū)π∈驦ewis肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及

2、對細(xì)胞因子調(diào)控的作用。
　　 [方法]
　　 在Genbank查找NF-κB/p65 cDNA序列(M61909)，利用Ambion公司提供的設(shè)計(jì)軟件，按照RNAi的設(shè)計(jì)原則，篩選出3個(gè)NF-κB/p65的干擾靶點(diǎn)，同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)陰性對照，并設(shè)計(jì)出相應(yīng)的shRNA模板，通過T4連接酶，將互補(bǔ)配對的shRNA模板分別插入到pGenesil-1質(zhì)粒中，構(gòu)建四種重組質(zhì)粒。用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(LL

3、C)中。RT-PCR檢測各轉(zhuǎn)染組mRNA的表達(dá)量的變化，Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組NF-κB/p65蛋白表達(dá)量的變化，篩選出沉默效果最好的表達(dá)質(zhì)粒。將篩選出的沉默效果最好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞，以空質(zhì)粒組和空白對照組作為對照組，MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制情況，Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液COX-2和TNF-α的含量。
　　 [結(jié)果]
　　 測序結(jié)果

4、顯示，NF-κB/p65 shRNA模板成功插入到pGenesil-1表達(dá)質(zhì)粒中，成功構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒。與空白對照、空質(zhì)粒對照及scramble對照相比，干擾組shRNA有效的降解NF-κB/p65 mRNA，尤其轉(zhuǎn)染pGenesil-1-p65-shRNA-2質(zhì)粒組干擾效果更為有效。轉(zhuǎn)染pGenesil-1-p65-shRNA-2質(zhì)粒組由于內(nèi)源性NF-κB/p65 mRNA減少，NF-κB/p65蛋白也相應(yīng)的減少。MTT結(jié)果顯示

5、，在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組的A值均降低，細(xì)胞增殖速度減慢，生長受到抑制，轉(zhuǎn)染后72h抑制率最高，干擾組與空質(zhì)粒組、空白對照組相比，對細(xì)胞生長抑制作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染72h后，空質(zhì)粒組的細(xì)胞細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，且強(qiáng)度較弱，轉(zhuǎn)染了干擾質(zhì)粒的細(xì)胞可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，細(xì)胞核中可見致密的強(qiáng)熒光，熒光增強(qiáng)，胞核縮小碎裂，呈大小不等的不規(guī)則塊狀細(xì)胞碎片。轉(zhuǎn)染Shuttle Vector1.0-CMV-P65-shRNA

6、-2干擾質(zhì)粒72h后，LLC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞凋亡率為：10.6％。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、空白對照組TNF-α、COX-2水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 NF-κB/p65特異的shRNA能夠有效抑制LLC細(xì)胞中NF-κB/p65基因的表達(dá)。NF-κB/p65基因被沉默后，對LLC細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，并促進(jìn)LLC細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，下調(diào)細(xì)胞因子TNF-α和COX