NF-κB-p65在EGCG抑制鼻咽癌干細胞干性中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一種源發(fā)于鼻咽部的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能，治療后部分病例容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，盡管放療技術(shù)不斷發(fā)展，鼻咽癌治療療效較十年前有一定的提高,但尚未取得滿意療效。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）理論從新的視角為鼻咽癌發(fā)生和復(fù)發(fā)機制提供了合理的解釋,認為鼻咽癌易局部侵襲、復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的特性與鼻咽癌干

2、細胞“干性”密切相關(guān)，靶向去除鼻咽癌干細胞，可能是一種“根治”性新策略。核轉(zhuǎn)錄因子κB( nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)為鼻咽癌疾病LMP1（EB病毒編碼的潛伏性膜蛋白1）所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中的信號傳導(dǎo)樞紐，它作為核轉(zhuǎn)錄因子能與靶基因啟動子或增強子區(qū)域的特定序列κB結(jié)合位點結(jié)合誘導(dǎo)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達從而發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、侵襲，抑制細胞凋亡及放化療抵抗等生物特性的功能。而信號

3、傳導(dǎo)中這種基因與基因功能區(qū)特異性序列相互結(jié)合及作用很可能為腫瘤發(fā)病中的關(guān)鍵機制及脆弱點。我們預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)鼻咽癌干細胞中NF-κB持續(xù)激活入核，同時高表達腫瘤干細胞基因Bmi-1、Twist1，但 NF-κB對鼻咽癌干細胞生物特性的具體調(diào)控功能及其與干細胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系目前尚不清楚，揭示這一病理機制，將為鼻咽癌治療提供新靶點和思路。研究顯示綠茶在防治癌癥疾病中展現(xiàn)良好潛能，其中表沒食子兒茶素沒食子酸脂（Epigallocatechin-

4、3-gallate，EGCG）是綠茶多酚成分防治癌癥的主要成分，其具有低毒、高效的靶向性特點，其抗癌機制與影響NF-κB通路活性密切相關(guān)，但EGCG抑制鼻咽癌干細胞的作用及具體機制尚不明確。本論文研究NF-κB/p65對鼻咽癌干細胞“干性”的功能調(diào)控并探索其調(diào)控機制與轉(zhuǎn)錄表達干細胞基因Bmi-1、Twist1的關(guān)系；并以此為靶向切入點，研究 EGCG靶向抑制鼻咽癌干細胞的作用及分子機制，旨在為完善鼻咽癌干細胞的發(fā)生、發(fā)展機制提供一定理論

5、依據(jù)，為挖掘低毒、高效的天然植物小分子靶向腫瘤干細胞的治療策略奠定實驗及理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1．鼻咽癌干細胞球的分離并鑒定其干性的研究
　　在優(yōu)化以往實驗條件基礎(chǔ)上采用無血清懸浮成球法從鼻咽癌細胞系 CNE2及 C666-1中富集能穩(wěn)定傳代的人鼻咽癌微球體；通過 MTT實驗檢測鼻咽癌成球細胞的增殖能力及化療藥物順鉑的耐受性；軟瓊脂克隆球形成實驗檢測其克隆形成能力；Transwell小室侵襲實驗檢測鼻咽癌成球

6、細胞的侵襲能力；裸鼠皮下成瘤實驗驗證其體內(nèi)成瘤能力；通過細胞免疫熒光、流式細胞儀分析干細胞標志物CD44的表達情況；Real Time PCR及Western blot于基因蛋白水平檢測EMT標志物及干細胞基因Bmi-1、Twist1的表達情況。
　　2、NF-κB/p65調(diào)控鼻咽癌干細胞的作用及機制研究
　　通過構(gòu)建NF-κB/p65慢病毒沉默鼻咽癌干細胞中p65的基因表達，再結(jié)合以上一系列的功能實驗（MTT實驗、軟瓊脂克

7、隆球形成實驗、Transwell小室侵襲實驗、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗）檢測沉默NF-κB/p65的表達對鼻咽癌干細胞增殖、耐藥、侵襲、成瘤等生物特性的影響；再通過Real Time PCR及Western blot實驗檢測沉默p65后EMT標志物及干細胞基因Bmi-1、Twist1的表達差異，最后構(gòu)建Twist1啟動子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)鼻咽癌干細胞球，用雙熒光素酶檢測沉默p65后Twist1啟動子活性的變化。
　　3、EGCG抑制 NF-κB/p

8、65活性調(diào)控鼻咽癌干細胞干性的作用及機制研究
　　EGCG各濃度干預(yù)鼻咽癌干細胞球后，通過MTT實驗、克隆球形成實驗、侵襲實驗及動物體內(nèi)成瘤實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細胞增殖、侵襲、成瘤等生物特性功能的影響；通過流式細胞儀分析 EGCG對鼻咽癌干細胞CD44+細胞比例的影響；利用細胞免疫熒光、Real Time PCR及Western blot實驗于細胞分子水平檢測EGCG對NF-κB/p65活性、EMT標志物及干細胞因子Bmi-

9、1、Twist1蛋白及基因表達的影響；再通過雙熒光素酶分析檢測EGCG對p65所調(diào)控的Twist1啟動子活性的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1．無血清懸浮培養(yǎng)富集獲得具有干細胞生物特性的鼻咽癌干細胞球
　　采用無血清懸浮培養(yǎng)成球法從人源化鼻咽癌細胞系 CNE2(低分化鱗癌)、C666-1(未分化型癌)中成功分離獲得鼻咽癌球細胞CNE2-SC(CNE2 sphere cells)及 C666-1-SC(C666-1 sph

10、ere cells)。將CNE2-SC及C666-1-SC重置于含10％的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其能分化為與親本細胞相同特性的貼壁細胞；免疫熒光結(jié)果提示：CNE2-SC及C666-1-SC較其親本細高表達 CD44；FACS檢測分析鼻咽癌球細胞CD44+細胞比例，結(jié)果顯示：CNE2-SC較CNE2 CD44+細胞比例（89.09±2.0%vs4.81±2.01%）及C666-1-SC較C666-1 CD44+細胞比例（87.21±3.24%

11、vs5.49±1.65%）均明顯偏高，具有顯著差異性（P<0.01）。qRT-PCR和Western blot檢測干細胞基因及EMT標志物的表達，結(jié)果顯示：與親本細胞比較，CNE2-SC、C666-1-SC細胞中Twist1、Bmi1及間葉標志物N-cadherin Vimentin的mRNA表達均顯著增高（P<0.01)，而上皮標志物 E-cadherin的 mRNA表達偏低(P<0.05)；Western blot實驗結(jié)果提示以上指

12、標蛋白表達差異與基因表達情況相符。MTT實驗結(jié)果提示：與親本細胞比較，CNE2-SC及C666-1-SC細胞增殖活性及對順鉑耐受性更強。Transwell侵襲實驗結(jié)果提示：CNE2-SC比CNE2的穿膜細胞數(shù)為268±6個/視野 vs76±7個/視野；而 C666-1-SC比C666-1的穿膜細胞數(shù)為258±8個/視野vs68±7個/視野，前者均明顯偏高，具有顯著性差異（ P<0.01)。軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果示：CNE2-SC、C66

13、6-1-SC分別比較CNE2及C666-1的克隆形成率為28±4%vs8±3%和26±3%vs7±2%，均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。裸鼠成瘤實驗結(jié)果示：1×104個CNE2-SC細胞于裸鼠體內(nèi)即能起始腫瘤的發(fā)生，在相同細胞數(shù)量時，CNE2-SC較CNE2成瘤體積更大,具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　2. NF-κB/p65在鼻咽癌干細胞球中激活，沉默其表達能抑制鼻咽癌干細胞增殖、侵襲、成瘤、耐藥
　　Wester

14、n blot檢測鼻咽癌干細胞球與親本細胞 NF-κB/p65表達差異，結(jié)果顯示：與CNE2及C666-1比較，CNE2-SC及C666-1-SC中NF-κB/p65蛋白表達明顯增強，且p65抑制物Ikba的磷酸化蛋白P-Ikba表達也明顯增強。細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn) NF-κB/p65于 CNE2及C666-1中主要表達定位于胞漿，而于CNE2-SC及C666-1-SC中核轉(zhuǎn)位主要表達定位于細胞核。構(gòu)建 p65三個序列的干擾慢病毒載體對C

15、NE2-SC、C666-1-SC進行轉(zhuǎn)染、內(nèi)源性篩靶、獲得穩(wěn)定干擾鼻咽癌干細胞株shp65-CNE2-SC及shp65-C666-1-SC；通過Western blot驗證穩(wěn)定細胞株p65干擾效率，結(jié)果示：shp65-CNE2-SC及shp65-C666-1-SC與對照干擾組（Scr組）比較，P65蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05）。軟瓊脂克隆形成實驗檢測p65穩(wěn)定干擾細胞株克隆形成能力，結(jié)果提示：shp65-CNE2-SC、shp65-

16、C666-1-SC分別較對照干擾細胞Scr-CNE2-SC、Scr-C666-1-SC的克隆球形成率均明顯降低，具有顯著差異性（P<0.01），且克隆球體變??；Transwenll小室實驗檢測p65穩(wěn)定干擾細胞株侵襲力變化，結(jié)果提示：shp65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC分別較Scr-CNE2-SC及Scr-C666-1-SC的穿膜細胞數(shù)明顯減少，具有顯著性差異（ P<0.01）。MTT實驗檢測不同濃度順鉑對 shp

17、65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC、Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC增殖抑制效應(yīng)，結(jié)果示：較對照干擾細胞株，shp65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC細胞存活比例明顯降低，具有差異性（P<0.05）。裸鼠皮下成瘤實驗檢測p65穩(wěn)定干擾細胞株體內(nèi)成瘤能力，結(jié)果示:shp65-CNE2-SC起始腫瘤的能力下降，接種1×106個細胞數(shù)量時，對照組成瘤率4/4，而shp65組成瘤率3/4，接

18、種1×105個細胞數(shù)量時，對照組成瘤率4/4，而shp65組成瘤率2/4，同一細胞數(shù)量級比較，shp65組形成移植瘤的重量減低，具有統(tǒng)計差異性（P<0.05）。
　　3.沉默NF-κB/p65表達抑制鼻咽癌干細胞球EMT及Twist1的轉(zhuǎn)錄表達
　　Western blot檢測沉默P65表達對鼻咽癌干細胞EMT標志物及干細胞基因表達的影響，結(jié)果示：與 Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC比較，shp65-CN

19、E2-SC和shp65-C666-1-SC的EMT標志物Vimentin、N-cadherin蛋白表達下降，而E-cadherin表達上升(P<0.05，P<0.01)，即 EMT過程受到抑制；與 Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC比較， shp65-CNE2-SC和shp65-C666-1-SC細胞中 Twist1及Bmi-1的蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)。構(gòu)建Twist1熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至P65

20、穩(wěn)定干擾細胞株及對照干擾細胞株中，熒光素酶檢測Twist1啟動子活性結(jié)果示：與對照組比較， shp65-CNE2-SC及 shp65-C666-1-SC中Twist1啟動子活性均降低，具有統(tǒng)計差異性(P<0.05)。
　　4．EGCG抑制鼻咽癌干細胞增殖、侵襲、成瘤能力
　　MTT實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細胞球細胞增殖活性的影響，結(jié)果示：與對照組（EGCG0μM）比較，EGCG各劑量干預(yù)組細胞存活比例呈劑量依賴性降低（P<

21、0.05，P<0.01）。細胞成球?qū)嶒灆z測EGCG對鼻咽癌干細胞二次成球能力的影響，結(jié)果示：與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細胞二次成球率呈劑量依賴性降低(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實驗驗證克隆形成能力，結(jié)果示：與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細胞克隆形成能力呈劑量依賴性抑制（P<0.05，P<0.01）；transwenll小室侵襲實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細胞的侵襲能力的影響，結(jié)果示：與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細胞穿膜細胞數(shù)呈劑

22、量依賴性逐漸降低（P<0.05，P<0.01）。采用經(jīng)各藥物組（DMSO組，EGCG20μM組,順鉑10μM組, EGCG20μM+順鉑10μM組）干預(yù)處理48小時后的CNE2-SC（1×106個數(shù)量級）行裸鼠皮下成瘤實驗，分析各組成瘤時間，結(jié)果顯示：EGCG組成瘤時間與對照組（DMSO組）比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),前者成瘤時間延遲；EGCG聯(lián)合順鉑組與對照組比較，具有顯著差異性(P<0.01)，與EGCG或順鉑單獨干預(yù)組比

23、較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),前者成瘤時間延遲。分析各組成瘤重量結(jié)果顯示：與對照組比較，EGCG組成瘤重量偏低(P<0.05)；而與順鉑組比較， EGCG組成瘤重量無明顯差異；但EGCG聯(lián)合順鉑組與對照組比較差異顯著(P<0.01)，與各單獨干預(yù)組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。分析比較各組不同時間成瘤體積差異，結(jié)果顯示：EGCG聯(lián)合順鉑組較對照組具有顯著性差異（P<0.01)，與各單獨干預(yù)組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；

24、EGCG組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但與順鉑組比較差異不明顯。
　　5．EGCG抑制鼻咽癌干細胞的EMT及Bmi-1、Twist1的表達
　　運用流式細胞儀檢測EGCG對CNE2-SC及C666-1-SC CD44+細胞比例的影響，結(jié)果顯示：與對照組（EGCG0uM）比較,EGCG（50μM）干預(yù)組中CNE2-SC細胞CD44+細胞比例由(90.14±3.76)%降低至(9.54±2.81)%；C666-1-

25、SC細胞中CD44+細胞比例由(85.04±3.30)%降低至(8.93±2.87)%，兩組干預(yù)前后比較具有顯著性差異（P<0.01）。從蛋白及基因水平驗證 EGCG對鼻咽癌干細胞 EMT及腫瘤干細胞基因的影響，RT-PCR檢測結(jié)果提示：N-cadherin、 Vimentin、CD44、Bmi-1、Twist1表達下降，而N-cadherin表達升高（P<0.05，P<0.01）；Western blot檢測結(jié)果提示：上述指標蛋白表達

26、趨勢與基因表達相符（P<0.05， P<0.01）。
　　6．EGCG抑制NF-κB/p65活性及影響p65對Twist1的轉(zhuǎn)錄表達
　　細胞免疫熒光及Western blot實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細胞中NF-κB/p65活性的影響，免疫熒光檢測結(jié)果示：與對照組（EGCG0μM）比較，EGCG（25μM，50μM）各干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC中NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位受抑制，核內(nèi)蛋白表達降低，且呈劑量依賴性

27、抑制效應(yīng)。Western blot檢測各EGCG干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC細胞總蛋白、胞漿蛋白及胞核蛋白p65和P-p65(p65磷酸化蛋白)的表達情況，結(jié)果顯示：各組細胞總蛋白中 p65表達未有明顯差異；但與對照組比較， EGCG各干預(yù)組細胞核中p65蛋白表達降低，而于細胞質(zhì)中p65蛋白表達有所升高，且上述變化趨勢呈劑量依賴性（P<0.05，P<0.01）；與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細胞總蛋白中P-p65蛋白表達呈劑

28、量依賴性減弱（P<0.05，P<0.01）。探索EGCG抑制鼻咽癌干細胞是否與影響P65對Twist1的轉(zhuǎn)錄表達有關(guān),通過雙熒光素酶實驗檢測分析各干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC細胞中Twist1啟動子活性變化，結(jié)果顯示:與對照組（Scr組）比較，EGCG(50μM)干預(yù)組及Shp65組的Twist1啟動子活性均減弱（ P<0.05）；而 shp65聯(lián)合 EGCG(50μM)干預(yù)組與EGCG(50μM)組或 Shp65組比較，

29、Twist1啟動子活性減弱更明顯（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1．無血清懸浮培養(yǎng)能富集具有干細胞生物特性的鼻咽癌干細胞球，其可作為理想的腫瘤干細胞研究模型。
　　2．NF-κB/p65在鼻咽癌干細胞中激活、調(diào)控 EMT及轉(zhuǎn)錄表達Twist1以維持鼻咽癌干細胞增殖、侵襲、耐藥、成瘤的生物特性。
　　3． EGCG通過抑制NF-κB/p65活性及EMT過程而抑制鼻咽癌干細胞干性。
　　4．NF-κB/p6