左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨骨髓中相關(guān)蛋白質(zhì)的影響.pdf

1、目的：
　　以卵巢切除大鼠作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型，用左歸丸進(jìn)行干預(yù)，在檢測(cè)腎虛狀態(tài)和補(bǔ)腎后骨量以及骨形成與骨吸收變化情況的基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從骨髓中探索左歸丸對(duì)去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的相關(guān)蛋白質(zhì)，從而存分子水半上揭示補(bǔ)腎方劑左歸丸對(duì)去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理，進(jìn)而為闡明“腎主骨”理論的科學(xué)內(nèi)涵提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1動(dòng)物分組和取材。
　　將100只雌性Wis

2、tar大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組20只、假手術(shù)組20只和造模組60只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組只摘取卵巢周圍的少許脂肪組織。手術(shù)2周后，將造模組大鼠隨機(jī)分為3組：模型組20只、己烯雌酚組20只、左歸丸組20只。分組后開(kāi)始給大鼠灌胃給藥：己烯雌酚組灌胃給予己烯雌酚0.046mg/kg，給藥濃度為0.0046mg/ml；左歸丸組灌胃給予左歸丸9.68g生藥/kg，給藥濃度為0.968g生藥/ml。給藥體積

3、均為1ml/100g體重。以上給藥一天一次，連續(xù)6天，休息一天后，再連續(xù)給藥6天，如此給藥12周。正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組則按同法灌服等體積的蒸餾水。每周稱重一次，據(jù)此調(diào)整給藥量。各組大鼠在處死前15天和前3天分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，將各組大鼠處死，取右側(cè)脛骨近端1/3，制作不脫鈣骨切片，其中一張甲苯胺藍(lán)染色，另一張切片則直接用于熒光觀察；左側(cè)脛骨近端1/3，制作冰凍切片，以作蛋白質(zhì)

4、的免疫組化法驗(yàn)證；取雙側(cè)股骨，用作蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳測(cè)定和免疫印跡驗(yàn)證。
　　2骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定。
　　采用Qwin V3圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠脛骨骨小梁體積百分比(TBV％)、骨小梁吸收表面百分比(TRS％)、骨小梁形成表面百分比(TFS％)、骨小梁礦化率(MAR)、類骨質(zhì)平均寬度(OSW)、骨皮質(zhì)礦化率(mAR)，觀察各組大鼠骨形成及骨吸收等骨代謝情況。
　　3骨髓蛋白質(zhì)分析鑒定。
　　分別提取正常

5、組、模型組和左歸丸組三組大鼠股骨骨髓蛋白質(zhì)，應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)分析比較三組大鼠股骨骨髓之間蛋白質(zhì)的表達(dá)，找出左歸丸調(diào)節(jié)糾正的去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠骨髓中的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過(guò)質(zhì)譜方法對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，獲取差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)信息。對(duì)差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果應(yīng)用免疫印跡法和免疫組化方法予以驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響。
　　1

6、.1左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠脛骨TBV％的影響。
　　模型組大鼠脛骨TBV％顯著低于假手術(shù)組。與模型組相比，左歸丸組、已烯雌酚組的TBV％均顯著升高。左歸丸組、已烯雌酚組的TBV％明顯低于假手術(shù)組。
　　1.2左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠脛骨TRS％的影響。
　　模型組大鼠脛骨TRS％較假手術(shù)組顯著增高。與模型組相比，左歸丸組和已烯雌酚組的TRS％均顯著降低。與假手術(shù)組相比，已烯雌酚組和左歸丸組的TRS％顯

7、著升高。
　　1.3左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠脛骨TFS％和MAR的影響。
　　模型組大鼠脛骨TFS％和MAR較假手術(shù)組皆顯著增高。與模型組相比，左歸丸組和己烯雌酚組的TFS％和MAR均顯著降低；而與假手術(shù)組相比，左歸丸組明顯增高，己烯雌酚組則無(wú)顯著性差異。
　　1.4左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠脛骨mAR和OSW的影響。
　　模型組大鼠脛骨mAR和OSW皆顯著高于假手術(shù)組。左歸丸組和己烯雌酚組的mAR

8、和OSW均明顯低于模型組；與假手術(shù)組相比，左歸丸組的mAR和OSW顯著增高，而己烯雌酚組無(wú)顯著性差異。
　　假手術(shù)組與空白對(duì)照組比較，以上指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，從而排除手術(shù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。
　　2左歸丸對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨骨髓中相關(guān)蛋白質(zhì)的影響。
　　2.1雙向凝膠電泳結(jié)果。
　　雙向凝膠電泳圖像結(jié)果經(jīng)Image Master2D Platinum5.0軟件分析，所識(shí)別的蛋白質(zhì)點(diǎn)個(gè)數(shù)為(826±35)，

9、以3倍差異表達(dá)做為標(biāo)準(zhǔn)，配合人工校正，在正常組、模型組和左歸丸組三組之間共找到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)為23個(gè)。
　　2.2質(zhì)譜分析結(jié)果。
　　對(duì)23個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解、質(zhì)譜分析得到PMF圖譜后，查詢NCBInr20111014數(shù)據(jù)庫(kù)，其中個(gè)12點(diǎn)由于數(shù)據(jù)搜索的蛋白的分?jǐn)?shù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而未得到鑒定(>61分具有統(tǒng)計(jì)意義)，11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定，其中兩個(gè)蛋白為未命名蛋白。在模型中骨髓高表達(dá)的蛋白包括白果糖醛縮酶A、抗氧化蛋白6、α

10、烯醇化酶、烯醇化酶3、白蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3；在模型組骨髓中低表達(dá)蛋白質(zhì)為碳酸酐酶1、S100-A8蛋白。
　　2.3蛋白質(zhì)驗(yàn)證結(jié)果。
　　2.3.1 Western-blot驗(yàn)證骨髓中果糖醛縮酶A蛋白表達(dá)的結(jié)果。
　　果糖醛縮酶A(ALDOA)蛋白在各組大鼠中均有表達(dá)，在模型組中表達(dá)水平較高，明顯高于正常組和左歸丸組，說(shuō)明ALDOA蛋白在去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠發(fā)病過(guò)程中為異常高表達(dá)蛋白，而具有補(bǔ)腎作用

11、的左歸丸對(duì)ALDOA蛋白的高表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用，這與凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符。
　　2.3.2免疫組化法驗(yàn)證骨髓中碳酸酐酶1和抗氧化蛋白6表達(dá)的結(jié)果。
　　2.3.2.1免疫組化法驗(yàn)證骨髓中碳酸酐酶1表達(dá)的結(jié)果。
　　碳酸酐酶1(CA1)在各組大鼠中均有表達(dá)，模型組大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞CA1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度較正常對(duì)照組顯著降低。左歸丸組CA1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯高于模型組，但與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異。說(shuō)明左歸丸對(duì)C

12、A1蛋白的低表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，結(jié)果與凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符。
　　2.3.2.2免疫組化驗(yàn)證骨髓中抗氧化蛋白6表達(dá)的結(jié)果。
　　抗氧化蛋白6(PRDX6)在各組大鼠中均有表達(dá)，模型組大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞PRDX6蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度較正常對(duì)照組顯著升高。左歸丸組PRDX6蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度顯著低于模型組，但與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異。說(shuō)明左歸丸對(duì)PRDX6蛋白的高表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，結(jié)果凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符。
　　結(jié)論：<

13、br>　　1.切除大鼠卵巢14周后，作為骨量主要標(biāo)志的脛骨TBV％顯著降低，而代表骨吸收參數(shù)的TRS％，以及代表骨形成參數(shù)的TFS％、MAR、OSW和mAR均顯著增高，說(shuō)明卵巢切除所造成的是一種骨吸收大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥；而左歸丸能存一定程度上使上述指標(biāo)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表明其對(duì)卵巢切除所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防作用。
　　2.應(yīng)用蛋白組學(xué)方法從大鼠股骨骨髓中分析鑒定出11個(gè)差異蛋白質(zhì)。其中，模型組骨髓中高表達(dá)而被左歸丸

14、下調(diào)至正常組水平的蛋白質(zhì)有果糖醛縮酶A、抗氧化蛋白6、α烯醇化酶、烯醇化酶3、白蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3；模型組骨髓中低表達(dá)而被左歸丸上調(diào)至正常組水平的蛋白質(zhì)有碳酸酐酶1、S100－A8蛋白。這些差異蛋白質(zhì)主要涉及能量代謝、抗氧化、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多方面的功能。說(shuō)明在分子水平上，左歸丸可通過(guò)調(diào)節(jié)骨髓內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和能量代謝以及氧化反應(yīng)等來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用。同時(shí)基于中醫(yī)理論對(duì)絕