hNT-4基因修飾嗅鞘細(xì)胞結(jié)合組織工程技術(shù)治療周圍神經(jīng)損傷的研究.pdf

1、目的:
　　1、研究體外高純度 Wistar乳鼠嗅鞘細(xì)胞(OECs)的培養(yǎng)方法;
　　2、研究 OECs與殼聚糖支架的組織相容性;
　　3、構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)橋接 Wistar大鼠10mm臂叢神經(jīng)缺損,研究此人工神經(jīng)橋接體的修復(fù)效果及這些促神經(jīng)再生因素之間的相互作用。
　　方法:
　　1、用差速貼壁法和化學(xué)抑制劑法進(jìn)行分離培養(yǎng) OECs:取3-5天的Wistar乳鼠嗅球,兩次差速貼壁分離培養(yǎng),阿糖胞苷抑制

2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，NGFRp75免疫組化染色計(jì)算OECs純度;
　　2、觀察嗅鞘細(xì)胞與殼聚糖的生物相容性:將傳代培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞分別接種至殼聚糖包被的培養(yǎng)板(實(shí)驗(yàn)組)和未處理的培養(yǎng)板(對(duì)照組)上進(jìn)行培養(yǎng),應(yīng)用DAPI熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖狀況;
　　3、將制備的組織工程化人工神經(jīng)移植進(jìn)行神經(jīng)缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn):以臂叢神經(jīng)損傷的Wistar大鼠為動(dòng)物模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組。A組:殼聚糖導(dǎo)管(橋接)+hNT4-OECs組;B組:

3、自體神經(jīng)移植組;C組:殼聚糖導(dǎo)管(橋接)組;D組:陰性對(duì)照組。于術(shù)后6、12周,應(yīng)用電生理檢測(cè)、HE染色、免疫熒光染色觀察嗅鞘細(xì)胞的存活、表達(dá)及周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)、功能的恢復(fù)情況。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng) NGFRp75免疫組織化學(xué)染色鑒定結(jié)果表明成功分離、培養(yǎng)OECs,細(xì)胞純度達(dá)95％以上;
　　2、OECs與殼聚糖支架的組織相容性:正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)凋亡細(xì)胞的百分率經(jīng)比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);
　　3

4、、大體觀察:術(shù)后動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的足底潰瘍、患肢屈曲攣縮及拖曳步態(tài),恢復(fù)情況以A、B組最好,C組次之,D組最差,6周以后有所改善,12周后大鼠處死,殼聚糖管吸收完全;
　　4、電生理檢測(cè):A組與C組、D組神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)和神經(jīng)動(dòng)作電位振幅(AMP)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),A組、B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
　　5、組織學(xué)觀察:神經(jīng)損傷后12周的恢復(fù)情況明顯優(yōu)于6周,A組、B組神經(jīng)纖維粗大、排列整

5、齊,包裹較厚髓鞘;C組神經(jīng)纖維排列稀疏呈波浪形,內(nèi)可見(jiàn)新生毛細(xì)血管及少量膠原纖維;D組神經(jīng)纖維紊亂分布,膠原組織較多。組織切片顯示在12周時(shí)A組神經(jīng)損傷處仍有GFP熒光表達(dá),表明嗅鞘細(xì)胞在人工神經(jīng)內(nèi)仍然存活。
　　結(jié)論:
　　1、應(yīng)用差速貼壁加化學(xué)抑制劑法可得到數(shù)量較大,純度較高的OECs;
　　2、殼聚糖導(dǎo)管具有良好生物相容性,可以作為神經(jīng)橋接管;
　　3、用殼聚糖制作三維支架,以hNT-4基因轉(zhuǎn)染的OECs為