全反式維甲酸促人臍血多能干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化.pdf

1、帕金森氏病是一種中老年常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，該病的病理生理過(guò)程主要為中腦黑質(zhì)區(qū)慢性進(jìn)展的多巴胺神經(jīng)元變性、缺失。目前的治療措施多為改善癥狀，不能夠改善多巴胺神經(jīng)元的變性、缺失，因而無(wú)法延緩病情的進(jìn)展。具有神經(jīng)分化潛能的干細(xì)胞可以通過(guò)移植替代變性、缺失的多巴胺神經(jīng)元，成為帕金森氏病治療的一種新的可以選擇的途徑。然而，選擇移植安全、有效、沒有倫理問題限制的干細(xì)胞來(lái)源，成為干細(xì)胞移植治療帕金森氏病需要進(jìn)一步探討的問題。
　　 研究目的

2、:
　　 通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討在全反式維甲酸作用下，具有多向分化潛能、低免疫原性的人臍帶血多能干細(xì)胞CB-SCs(cord blood-stem cells)向多巴胺能神經(jīng)元的分化。
　　 研究方法:
　　 1.采集臍帶血樣本:告知并簽訂知情同意書后，采集濟(jì)南市中心醫(yī)院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦臍帶血樣本10例。
　　 2.CB-SCs分離、培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:分離、培養(yǎng)臍帶血干細(xì)胞CB-SCs達(dá)到一定數(shù)量后，分為無(wú)血清培養(yǎng)基

3、對(duì)照組、神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組、誘導(dǎo)組:無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)照組使用原培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12～14d，神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組換用神經(jīng)培養(yǎng)基孵育12～14d，誘導(dǎo)組換用含有10μmol/L全反式維甲酸的神經(jīng)培養(yǎng)基孵育12～14d。
　　 3.Real-timePCR檢測(cè):采用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)CB-SCs的多巴胺神經(jīng)元分化的、重要調(diào)控因子Nurr1、Wnt1、En1表達(dá)。
　　 4.免疫熒光化學(xué)檢測(cè):將誘導(dǎo)組、神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組的細(xì)

4、胞固定、制作標(biāo)本后，采用免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物神經(jīng)核蛋白NeuN的表達(dá)，以及多巴胺神經(jīng)元特異性酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transportor，DAT)的表達(dá)。
　　 5.ELISA檢測(cè):使用含有56mmol/L鉀離子的Hank's平衡鹽溶液刺激CB-SCs分化來(lái)源的細(xì)胞去極化，收集誘導(dǎo)組和神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)上清液中

5、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.人臍血干細(xì)胞CB-SCs表達(dá)Nurr1、Wnt1、En1基因未經(jīng)過(guò)任何基因修飾和處理，CB-SCs在mRNA水平自身表達(dá)多巴胺神經(jīng)元重要調(diào)控因子Nurr1、Wnt1、En1。
　　 2.全反式維甲酸促進(jìn)CB-SCs分化呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)經(jīng)過(guò)10Iμmol/L全反式維甲酸的神經(jīng)培養(yǎng)基孵育12～14天后，大部分CB-SCs分化為神經(jīng)形態(tài)樣細(xì)胞;神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組僅少

6、量CB-SCs出現(xiàn)神經(jīng)樣分化;無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)照組CB-SCs繼續(xù)擴(kuò)增并保持CB-SCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)不變。
　　 3.分化的CB-SCs表達(dá)多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志物通過(guò)細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)分析，誘導(dǎo)組70±7％細(xì)胞表達(dá)NeuN;48±11％的細(xì)胞表達(dá)TH;36±9％的細(xì)胞表達(dá)DAT。神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組僅有少量細(xì)胞表達(dá)TH和DAT，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞＜15％。
　　 4.分化的CB-SCs具有釋放多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的功能通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)

7、數(shù)據(jù)分析，經(jīng)過(guò)鉀離子刺激去極化誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液中多巴胺含量大約為940±42pg/mL，較神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組明顯升高，P＜0.001;神經(jīng)培養(yǎng)基對(duì)照組僅有基礎(chǔ)量的多巴胺遞質(zhì)釋放，370±15pg/mL。
　　 結(jié)論:
　　 1.CB-SCs在基因水平表達(dá)多巴胺神經(jīng)元分化的重要調(diào)控因子Nurr1、Wnt1、En1，具有向多巴胺神經(jīng)元分化的潛能。
　　 2.全反式維甲酸可以促進(jìn)CB-SCs較為高效地分化為多巴胺神經(jīng)元，