正常和炎癥來源的人牙周膜干細(xì)胞內(nèi)皮向分化能力的比較研究.pdf

1、牙周病作為口腔常見慢性疾病會導(dǎo)致牙周支持組織的破壞,包括硬組織如牙槽骨的吸收和軟組織如牙齦的退縮等,如未及時(shí)治療,將會導(dǎo)致牙齒的松動甚至缺失,嚴(yán)重影響人們的健康生活。目前牙周支持組織的再生和重建仍然是牙周治療尚未解決的難題,近年來組織工程成為牙周再生研究的熱點(diǎn)方向,其中的種子細(xì)胞來源及其功能表現(xiàn)更是關(guān)鍵性影響因素。牙周膜干細(xì)胞(periodontalligamentstemcells,PDLSCs)由于組織來源相近、高度增殖能力及多向分

2、化能力等特點(diǎn)已成為牙周組織工程的首選種子細(xì)胞。但牙周膜干細(xì)胞通常需要取健康人因正畸或阻生所拔除的牙齒,來源比較局限,因此炎癥組織來源的牙周膜干細(xì)胞(inflammatoryderivedperiodontalligamentstemcells,iPDLSCs)也已經(jīng)被分離培養(yǎng)和鑒定,并證明其同樣具有高度增殖能力,多向分化能力等種子細(xì)胞特征。正常和炎癥來源的牙周膜干細(xì)胞均能在成骨、成脂微環(huán)境中正常分化,但兩者的分化能力差異比較目前仍有爭議

3、。組織工程三要素還包括細(xì)胞因子和支架材料,除此之外,血供也是不容忽視的要素。通過組織工程技術(shù)再生的組織只有在血供充足的情況下才能穩(wěn)定生存。而牙周組織工程所涉及的牙根面部位和需要重建的大量牙槽骨缺損處,必須有血管的形成才能為再生組織提供營養(yǎng),這是保證牙周再生獲得成功不可缺少的一環(huán)。前期骨髓來源、脂肪來源、皮膚來源等的間充質(zhì)干細(xì)胞均被證明在成血管培養(yǎng)基誘導(dǎo)下能向內(nèi)皮細(xì)胞分化且具有成血管能力,并且炎癥環(huán)境可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化。因此本

4、實(shí)驗(yàn)旨在探索牙周膜干細(xì)胞是否具有內(nèi)皮向分化能力,并同時(shí)比較正常和炎癥來源的牙周膜干細(xì)胞成血管能力的差異,以期為牙周膜干細(xì)胞成骨及成血管能力的共同實(shí)現(xiàn)提供參考,為牙周組織工程的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　研究目的:
　　通過成血管培養(yǎng)條件誘導(dǎo)正常和炎癥來源的人牙周膜干細(xì)胞,觀察其內(nèi)皮向分化的能力,并且比較其成血管能力的差異,為牙周組織再生的作用機(jī)制及應(yīng)用提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定:臨

5、床收集正常和炎癥來源的離體牙,通過改良酶組織塊消化法分離培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞,經(jīng)有限稀釋法純化得到牙周膜干細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)記物;CCK-8法檢測并比較PDLSCs和iPDLSCs的生長曲線及增殖能力;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測PDLSCs和iPDLSCs自我更新能力并比較克隆形成率的大小。
　　2、牙周膜干細(xì)胞的內(nèi)皮向誘導(dǎo):當(dāng)PDLSCs和iPDLSCs生長達(dá)80％-90%匯合時(shí),棄原培養(yǎng)液,加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含20mL/L胎牛血清

6、,10mL/L青霉素鏈霉素混合液,25ng/mLVEGF,25ng/mLbFGF的?-MEM培養(yǎng)液),常規(guī)條件下培養(yǎng)10天。
　　3、體外檢測并比較PDLSCs和iPDLSCs成血管能力:通過免疫熒光、real-timeRT-PCR、Matrigelassay來檢測PDLSCs和iPDLSCs內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)及體外管腔形成能力。
　　4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測PDLSCs和iPDLSCs成血管能力:掃描電鏡觀察PDLSCs和iPD

7、LSCs在HA/β-TCP材料表面的黏附伸展情況,并植入裸鼠皮下,3周后取材,組織學(xué)觀察其體內(nèi)成血管能力。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)(?x±s)進(jìn)行方差分析,兩兩比較用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)?=0.05。
　　研究結(jié)果:
　　1、經(jīng)培養(yǎng)純化成功獲取PDLSCs和iPDLSCs,顯微鏡下觀察細(xì)胞均呈長梭形紡錘狀;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞均陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物:CD29、CD90、CD105、CD14

8、6,兩者表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物:CD34、CD45。CCK-8檢測結(jié)果顯示PDLSCs和iPDLSCs生長曲線均呈“S”型,6天前各時(shí)間點(diǎn),iPDLSCs的數(shù)量高于正常PDLSCs,尤其是第3和第4天,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PDLSCs和iPDLSCs均具有一定的克隆形成能力,其中iPDLSCs克隆形成率高于PDLSCs,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、PDLSCs和iPDLSCs經(jīng)成血管誘導(dǎo)10天后

9、,顯微鏡下觀察細(xì)胞呈“鵝卵石”樣,與內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)基本相同。
　　3、PDLSCs和iPDLSCs內(nèi)皮向誘導(dǎo)10天后,免疫熒光檢測顯示兩者均陽性表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VEGF、vWF,iPDLSCs表達(dá)的陽性率高于PDLSCs;real-timeRT-PCR檢測兩者誘導(dǎo)后均表達(dá)CD31、vWF、VE-cadherin,其中iPDLSCs的CD31、VE-cadherinmRNA表達(dá)水平均明顯高于PDLSCs,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

10、5);誘導(dǎo)后的PDLSCs和iPDLSCs均能在Matrigel基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu),并相連成網(wǎng)狀,通過軟件半定量分析,iPDLSCs形成的分支節(jié)點(diǎn)數(shù)、管腔長度均高于PDLSCs,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4、經(jīng)掃描電鏡觀察,PDLSCs和iPDLSCs在HA/β-TCP表面均能正常黏附并伸展,植入裸鼠皮下3周后HE染色可見有新生血管生成,其中炎癥來源的牙周膜干細(xì)胞誘導(dǎo)組形成的血管數(shù)量最多,免疫組化染色可見誘導(dǎo)后的