重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白臨床新靶點研究.pdf

1、重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（簡稱TNHH）在白細胞抑制因子（NIF）和水蛭肽（Hirulog）中間加入了一段交聯(lián)肽，能與血凝塊中纖維蛋白結合的導向性，實現(xiàn)了降低NIF和Hirulog片段的風險性，增加有效性的目的，能有效抑制白細胞活化、遷移、粘附功能，抑制凝血酶活性、血細胞與纖維蛋白結合。本品在急性缺血性腦卒中動物模型中具有多重功效，能有效促進腦組織損傷修復和保護，改善局部抗凝微循環(huán)和血流再灌注，抑制凝血酶引起的腦水腫，促進腦血

2、腫的吸收。
　　目的：
　　探討重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白臨床新靶點。
　　方法：
　　取健康人的纖維蛋白原（FIB）、抗凝血酶III（AT-III）和纖維蛋白溶酶原（PLG）分別與TNHH進行體外結合實驗，具體采用免疫印跡鑒別實驗及分別結合HPLC分析，抗凝血酶III（AT-III）活性分析，D-二聚體轉化實驗中的D-二聚體含量測定分析判定。在上述實驗判定靶點基礎上，利用CADD（計算機輔助藥物設計）與

3、可能的新靶點纖維蛋白原（FIB），抗凝血酶III（AT-III）和纖維蛋白溶酶原（PLG）進行分子對接（DOCK），采用PSIPRED2.4，Sybyl8.0和DiscoveryStudio2.5軟件進行靶點驗證結果。
　　結果：
　　重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH)分別與纖維蛋白原（FIB），抗凝血酶III（AT-III）和纖維蛋白溶酶原（PLG）進行免疫印跡鑒別實驗，兔抗TNHH多抗與TNHH+FIB和TN

4、HH+AT-III實驗組的免疫印跡結果呈陰性，而與TNHH+PLG實驗組的免疫印跡結果呈陽性。鼠抗纖維蛋白原（FIB）單抗，鼠抗凝血酶III（AT-III）單抗分別與TNHH+FIB和TNHH+AT-III實驗組的免疫印跡結果呈陰性，而鼠抗維蛋白溶酶原（PLG）單抗和TNHH+PLG的免疫印跡結果呈陽性。這說明TNHH中不含有纖維蛋白原（FIB）或抗凝血酶III（AT-III），而TNHH中含有維蛋白溶酶原（PLG），表示TNHH與FI

5、B或AT-III無結合，而與PLG有結合。將纖維蛋白原（FIB）與TNHH進行體外結合實驗的HPLC分析，結果顯示：標準對照TNHH的保留時間為16.335min，峰面積為33578168.000；陽性對照TNHH+兔抗TNHH多抗中TNHH的保留時間為16.095min，峰面積為13985716.804；實驗組TNHH的保留時間為15.655min，峰面積為34964292.010；這表明標準對照中的TNHH和實驗組中的TNHH峰面積

6、并沒有太大差異，表明FIB與TNHH無結合。將抗凝血酶III（AT-III）與TNHH進行體外結合實驗的AT-III：A活性分析，結果顯示：標準對照AT-III的活性為104.7％，陽性對照AT-III的活性為48%，實驗組AT-III的活性為109.3%，這表明標準對照AT-III和實驗組AT-III的活性二者之間并沒有顯著的差異，說明抗AT-III與TNHH無結合，不能抑制抗凝血酶III的活性。將纖維蛋白溶酶原（PLG）與TNHH進

7、行體外結合實驗的D-二聚體轉化實驗分析，結果顯示：陽性對照有D-二聚體生成，并且含量為0.246mg/L。實驗組有D-二聚體生成，并且含量為0.068mg/L。這說明纖維蛋白溶酶原（PLG）與TNHH有結合，產(chǎn)生纖維蛋白溶酶，纖維蛋白溶酶催化纖維蛋白降解生成D-二聚體。通過計算機輔助藥物設計（CADD）的PSIPRED，Sybyl8.0和DiscoveryStudio2.5軟件分析，纖維蛋白溶酶原（PLG）C端的第153位Arg至175

8、位的Tyr為一段保守序列RNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDY與重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的C端的第133位Lys至140位的Tyr為一段保守序列KEGEGVLY在蛋白質(zhì)的空間結構中存在相互作用，而纖維蛋白原（FIB）和抗凝血酶III(AT-III)均沒有功能核心區(qū)域與TNHH之間有相互作用。
　　結論：
　　通過免疫印跡鑒別實驗，HPLC實驗，AT-III：A活性實驗和D-二聚體轉化實驗分析，以