鞏膜核黃素-紫外線A膠原交聯(lián)的實驗研究.pdf

1、早在1998年，Spoerl等通過不同的膠原交聯(lián)方法對豬角膜進行膠原交聯(lián)發(fā)現(xiàn)，紫外線A段(ultraviolet-A:UVA)聯(lián)合核黃素照射，低濃度的戊二醛溶液以及Karnovsky's溶液均可增強角膜生物力學硬度。此后，經(jīng)過各學科專家的共同努力，經(jīng)過大量的基礎(chǔ)試驗研究，于2003年，Wollensak等首次將角膜膠原交聯(lián)療法(collagen crosslinking: CXL)用于進展期圓錐角膜的治療，經(jīng)過3個月到4年的隨診發(fā)現(xiàn):患

2、者術(shù)后散光平均減少2.01D，屈光度數(shù)減少1.14D，約65％的患者經(jīng)過治療后視力竟然有輕度提高，而且該治療對角膜和晶狀體的透明度、角膜內(nèi)皮細胞密度、眼壓等均無影響。之后，此方法迅速被廣大眼科專家所接受，用于進展期圓錐角膜患者的治療。
　　圓錐角膜的特點是漸進性、非炎性角膜實質(zhì)變薄，且角膜中央部呈圓錐狀前凸;進展性近視有相似的發(fā)病特點，在近視進展的過程中鞏膜組織進行性變薄，尤其是后極部鞏膜，嚴重者有后鞏膜葡萄腫的發(fā)生。核黃素/紫外

3、線A膠原交聯(lián)可以對圓錐角膜疾病的進展起一定的阻止作用，該作用是否適用于鞏膜？這一問題引發(fā)了眼科學者的思考。Wollensak和Spoerl于2004年將核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)方法用于離體豬和人鞏膜發(fā)現(xiàn):經(jīng)該方法照射后人鞏膜和豬鞏膜硬度和彈性模量均有顯著性增加。但是相對于核黃素/紫外線A角膜膠原交聯(lián)，鞏膜膠原交聯(lián)的基礎(chǔ)研究相對比較貧乏，鞏膜膠原交聯(lián)的治療參數(shù)大多是參照角膜膠原交聯(lián)的數(shù)據(jù);鞏膜和角膜組織不管是在纖維的構(gòu)成還是排列上都是有區(qū)

4、別的，因而適用于治療圓錐角膜的核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)的最佳治療參數(shù)并不一定適用于進展期近視的鞏膜治療。本研究的第一步就是研究適合于兔鞏膜的核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)的治療參數(shù)，即在活體兔鞏膜上進行核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)，我們將能量密度設(shè)為3mW/cm2，對其進行不同時間段的紫外線A照射，根據(jù)其生物力學參數(shù)的改變和是否對視網(wǎng)膜等眼內(nèi)組織造成損傷，得出該治療措施的最佳照射時間。另外，由于倫理學原因，動物試驗階段的鞏膜膠原交聯(lián)療法是不能直接

5、應用于人鞏膜的，而目前我們所能獲得的新鮮的人的鞏膜是非常有限的;因而豬和兔鞏膜通常被作為人鞏膜的動物模型。我們研究的第二步就是將第一部研究得出的最佳治療參數(shù)分別應用于離體兔、豬和人鞏膜，評估核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)前后的生物力學性能，為找出更適合該試驗的、更接近人鞏膜的動物鞏膜模型提供參考，為鞏膜膠原交聯(lián)的發(fā)展提供試驗基礎(chǔ)。
　　第一部分、兔鞏膜核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)最佳照射能量的研究
　　目的:
　　明確在活體兔鞏

6、膜上進行核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)的效果，探討紫外線A能量密度為3mW/cm2時的核黃素/紫外線A兔鞏膜膠原交聯(lián)的最佳照射時間。
　　方法:
　　1、實驗設(shè)計:本研究中包括36只新西蘭大白兔，根據(jù)紫外線A照射的時間不同（10，20，30，40，50或60分鐘）平均分為6組，能量密度為3mW/cm2，紫外線A波長為365nm，利用不含右旋糖酐的0.1％核黃素作為光敏劑。每只新西蘭大白兔僅左眼作為照射眼，進行膠原交聯(lián)治療;右眼作為

7、對照眼，不進行任何治療。所有的新西蘭大白兔在治療后24小時處死，然后將其眼球摘除，在每組試驗動物中拿出一只治療眼做組織病理學檢驗，其他的均做生物力學測試，測試參數(shù)為極限應力、彈性模量及生理范圍的彈性模量。
　　2、核黃素/紫外線A膠原交聯(lián):將新西蘭大白兔全麻后分離左眼鼻上象限結(jié)膜及結(jié)膜下組織，分離的面積要大于9mm×9mm，用5-0尼龍線在角鞏膜緣后2mm做兩個固定線，以方便牽拉固定眼球。于照射前15分鐘開始點0.1％核黃素溶液，

8、每3分鐘點一次，點夠5次后，進行紫外線A照射。照射距離為50mm，照射面積為9mm×9mm，每次照射前均需測試紫外線A的發(fā)射能量，確保在3mW/cm2水平后才能開始。照射過程中每3min點一次0.1％核黃素溶液。照射完畢后，拆除鞏膜縫線，用7-0可吸收縫線縫合結(jié)膜及結(jié)膜下組織，0.3％左氧氟沙星滴眼液點眼。
　　3、鞏膜生物力學測試:在照射區(qū)域取2條3mm×12mm的鞏膜條帶，在INSTRON試驗機上進行應力-應變生物力學測試。鞏

9、膜條帶垂直夾在試驗機的兩個夾頭上，距離為4～6mm;對于測試組，夾頭間的鞏膜組織均為經(jīng)過膠原交聯(lián)的組織。測試進行前先將條帶加載-卸載7次循環(huán)，然后以2mm/min的加載速度逐漸增加負荷，直至試件被拉斷破壞。試件破壞點的應力即極限應力。根據(jù)試驗得出的數(shù)據(jù)可計算出照射區(qū)鞏膜組織的彈性模量以及生理范圍的彈性模量。
　　4、組織病理學觀察切取照射部位的鞏膜、脈絡膜和視網(wǎng)膜組織，石蠟包埋，4μm切片，進行HE染色觀察照射區(qū)域組織的改變情況。

10、
　　結(jié)果:
　　1、照射時間為10分鐘和20分鐘組，極限應力、彈性模量和生理范圍彈性模量與未照射組相比均無顯著性改變(p＞0.05)。
　　2、照射時間大于等于30分種組，生理范圍彈性模量與未照射組相比有顯著性增加(p＜0.05)。
　　3、照射時間大于等于40分鐘組，極限應力、彈性模量及生理范圍彈性模量與未照射組相比均有顯著性增加(p＜0.05)。
　　4、照射區(qū)域鞏膜組織病理學檢查均顯示有炎癥細胞浸潤

11、;照射時間小于等于40分鐘組均未見有視網(wǎng)膜的損傷;照射時間為50分鐘和60分鐘組顯示有視網(wǎng)膜的損傷。
　　結(jié)論:
　　1、核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)可顯著增加兔鞏膜生物力學性能。
　　2、核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)的照射能量不同可引起不同的交聯(lián)效果，照射能量過強可引起眼內(nèi)組織的損傷。
　　3、生理范圍彈性模量是一比較敏感的測試膠原交聯(lián)效果的生物力學指標。
　　4、能量密度為3mW/cm2時，核黃素/紫外線A兔鞏

12、膜膠原交聯(lián)的最佳照射時間是40分鐘。
　　第二部分、兔、豬、人鞏膜核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)前后生物力學性能的比較研究
　　目的:
　　比較核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)前后豬、兔和人鞏膜的生物力學性能，明確在鞏膜膠原交聯(lián)前后的應力-應變生物力學測量上豬鞏膜和兔鞏膜誰更接近人鞏膜，為尋找更好的代表人鞏膜的動物模型提供試驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、實驗設(shè)計:本研究中包含8只成年新鮮離體豬眼，8只成年新鮮離體人眼，以

13、及8只成年新西蘭大白兔。對于豬眼和人眼，首先以矢狀位方向?qū)⑵淦骄譃閮砂?，一半作為試驗對照不做任何處理，另一半取?0mm×20mm大小的鞏膜組織做核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)用的鞏膜試件，制作該鞏膜試件時盡量避開眼外肌附著點的位置。新西蘭大白兔用空氣栓塞法處死，并立即將其眼球取出，由于兔眼球較小，其材料無法滿足上述要求，因而其一眼作為試驗對照不做任何處置，另一眼做一10mm×20mm的鞏膜試件，用于核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)。所有材料在膠原

14、交聯(lián)前后均放于4度濕房保存。每個經(jīng)過交聯(lián)的試件以及對照組均做兩條3.5mm×15mm條帶，用于應力-應變生物力學測量。測試指標包括:極限應力，4％，6％和8％應變條件下的應力和彈性模量。膠原交聯(lián)的參數(shù)為:0.1％核黃素溶液（不含右旋糖酐）作為光敏劑，365nm波長的紫外線A，其能量密度為3mW/cm2，照射時間是40分鐘;每次交聯(lián)前均需測試紫外線A的發(fā)射能量，確保在3mW/cm2水平后才能開始照射。
　　2、鞏膜生物力學測試:所有

15、測試條帶均在同一測試條件下的INSTRON試驗機上進行試驗。鞏膜條帶垂直夾在試驗機的兩個夾頭上，距離為4～6mm;對于測試組，夾頭間的鞏膜組織均為經(jīng)過膠原交聯(lián)的組織。測試進行前先將條帶加載-卸載7次循環(huán)，然后以2mm/min的加載速度逐漸增加負荷，直至試件被拉斷破壞。試件破壞點的應力即極限應力。根據(jù)計算機得出的數(shù)據(jù)可以計算出不同應變條件下的應力和彈性模量。
　　結(jié)果:
　　1、8％應變條件下，豬、兔和人鞏膜彈性模量分別為2.

16、88±1.55×106 Pa，4.46±4.09×106 Pa，和14.31±8.56×106 Pa;應力分別為231.6±112×103Pa,359.1±305.3×103 Pa，和1078.8±645.8×103Pa;人鞏膜的應力值和彈性模量值約是豬鞏膜的4倍，是兔鞏膜的3倍。
　　2、在同一核黃素/紫外線A膠原交聯(lián)條件下，兔鞏膜在應力和彈性模量上均有顯著性提高(p＜0.05);豬鞏膜僅在極限應力指標上有顯著性提高(p＜0.0