PEBP1和ATP5H在兒童先天性腎積水腎臟中表達(dá)的研究.pdf

1、目的
　　探討ATP5H和PEBP1在先天性腎盂輸尿管連接部梗阻導(dǎo)致的腎積水腎損傷中的作用機(jī)制。
　　材料與方法
　　1、標(biāo)本來源
　　中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院201111月-2013年9月小兒泌尿外科手術(shù)治療的20例PUJO所致單側(cè)先天性腎積水患者，術(shù)前均行靜脈腎盂造影(IVP)、ECT及延遲增強(qiáng)三維重建CT檢查，并經(jīng)手術(shù)證實(shí)為PUJO所致的先天性腎積水。年齡2月-10歲，平均2.75±3.08歲，男14例，女

2、6例;左側(cè)18例，右側(cè)2例。SPU分級:Ⅳ級6例，Ⅲ級14例。經(jīng)倫理委員會的批準(zhǔn)，患者家屬知情同意，留取腎積水腎實(shí)質(zhì)，新鮮離體組織30分鐘內(nèi)-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩φ战M為同期手術(shù)治療的7例腎母細(xì)胞瘤患兒的瘤旁組織，病理均為Ⅰ期，術(shù)前未接受化療。
　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　(1)HE染色
　　制作石蠟切片，脫蠟，蘇木素伊紅染色，脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。
　　(2)免疫組織化學(xué)法
　　SP免疫組織化學(xué)方法，實(shí)

3、驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。免疫組織化學(xué)結(jié)果中，用NISEElements軟件分析系統(tǒng)鏡下采集圖片，進(jìn)行定量分析，褐色和黃色的部位代表陽性染色，總的光強(qiáng)度值為組織所有陽性顏色區(qū)域的和。
　　(3)Westernblot
　　取組織塊提取總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印后分別用抗PEBP1和抗ATP5H抗體孵育，加入用堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，顯色后置于凝膠成像儀成像。
　　(4)Real-timePCR
　

4、　Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增。
　　(5)ECT（腎動態(tài)顯像）測定分腎功能
　　3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，積水組與正常對照組間比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)，皮爾森相關(guān)系數(shù)評估變量之間的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，p＜0.05為差異具有顯著性意義。
　　結(jié)果
　　1、HE染色結(jié)果
　　先天

5、性腎積水患兒的腎臟組織可見腎小管明顯擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞變?yōu)楸馄?腎小球的鮑曼囊出現(xiàn)擴(kuò)張;正常對照組腎臟未見異常改變，無腫瘤細(xì)胞浸潤。
　　2、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　在正常對照組中，PEBP1和ATP5H呈陽性表達(dá)，表達(dá)在腎小球或腎小管的細(xì)胞胞漿（主要位于近端腎小管細(xì)胞胞漿）。積水組PEBP1和ATP5H呈陽性表達(dá)，表達(dá)在腎小球或腎小管的細(xì)胞胞漿（主要位于近端腎小管細(xì)胞胞漿），表達(dá)量較正常組減少。積水組PEBP1和ATP

6、5H光密度值分別為123.04±2.74和123.16±3.44，對照組PEBP1和ATP5H光密度值為126.73±2.43和126.45±1.95，(P=0.004和P=0.001)。
　　3、Westernblot檢測結(jié)果
　　Westernblot結(jié)果顯示:以β-actin的表達(dá)量作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得相對表達(dá)強(qiáng)度，PEBP1在積水組為0.69±0.24，在正常對照組為1.69±0.71;ATP5H在積水組為0.7

7、6±0.33，在正常對照組為1.39±0.56(P=0.000和P=0.001)。PEBP1和ATP5H在積水組腎臟組織的表達(dá)明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、Real-timePCR檢測結(jié)果
　　Real-timePCR結(jié)果顯示:采用相對定量2-△△Ct法比較各基因，PEBP1mRNA的表達(dá)在積水組是正常對照組的0.86倍;ATP5HmRNA的表達(dá)在積水組是正常對照組的0.27倍(P=0.547和P=0.55

8、9)。
　　5、相關(guān)性分析結(jié)果
　　ATP5H基因的表達(dá)與分腎功能無明顯相關(guān)(r=0.14;P=0.566)，ATP5H蛋白的表達(dá)與分腎功能呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66;P=0.002)，PEBP1基因的表達(dá)與分腎功能無明顯相關(guān)(r=-0.079;P=0.740)，PEBP1蛋白的表達(dá)與分腎功能呈負(fù)相關(guān)(r=-0.49;P=0.030)。
　　結(jié)論
　　在PUJO所致先天性腎積水患兒的腎實(shí)質(zhì)中，PEBP1和ATP5H