鈣離子通道蛋白CACNA1C與DLBCL免疫化療療效相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、背景
　　彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的一種侵襲性淋巴瘤，其治療和預(yù)后在過去10年取得了巨大的進(jìn)步。雖然DLBCL有很多亞型，但其共同點(diǎn)就是腫瘤細(xì)胞高度表達(dá)CD20抗原?？笴D20單克隆抗體利妥昔單抗的出現(xiàn)被認(rèn)為是B細(xì)胞淋巴瘤治療上的一個(gè)重大突破。大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，利妥昔單抗聯(lián)合CHOP的免疫化療方案(R-CHOP)明顯提高了DLBCL患者的緩解率和生存率。因此2003年NCCN治療指南將R-CHOP方案作為DLBCL

2、的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，對(duì)于部分患者，利妥昔單抗的應(yīng)用并沒有增加CHOP方案的療效，而是表現(xiàn)出耐藥、早期或晚期復(fù)發(fā)。研究顯示，鈣通道和泵與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，鈣離子傳導(dǎo)通路在利妥昔單抗相關(guān)的細(xì)胞凋亡中也起重要作用，因?yàn)樵诒焕孜魡慰箽⑺赖募?xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣的增高。基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在對(duì)免疫化療不同反應(yīng)的患者中，存在鈣通道蛋白CACNA1C的差異性表達(dá)，因此鈣通道蛋白與免疫化療療效的關(guān)系值得深入研究。
　　目的
　　明

3、確CACNA1C與DLBCL患者免疫化療療效的關(guān)系，尋找提高其療效的方法。
　　材料與方法
　　選取2007-2012年鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院R-CHOP方案初治的DLBCL患者111例，收集臨床資料和病理科存檔的石蠟組織，根據(jù)療效，將其分為敏感組和耐藥組。選取DLBCL兩種細(xì)胞株OCI-Ly7和OCI-Ly3，其中OCI-Ly7是對(duì)利妥昔單抗敏感的細(xì)胞系，OCI-Ly3是對(duì)利妥昔單抗耐藥的細(xì)胞系。
　　1臨床研究部分<

4、br>　　選取DLBCL患者48例用來做預(yù)實(shí)驗(yàn)基因芯片，基因表達(dá)譜結(jié)果分析，在耐藥組和敏感組中，鈣通道基因存在差異性表達(dá)，其中CACNA1C差異性較明顯，CD20表達(dá)無明顯差異。再選取DLBCL患者63例，敏感組41例，耐藥組22例。從石蠟組織中提取RNA，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測患者基因CACNA1C的表達(dá)量。應(yīng)用免疫組化的方法分別檢測患者中CACNA1C和CD20的表達(dá)量。
　　2基礎(chǔ)研究部分
　　2.1應(yīng)用CCK-8

5、法分別檢測利妥昔單抗、表阿霉素作用于兩種細(xì)胞株細(xì)胞增殖的情況。篩選出藥物的最佳作用濃度，為后期藥物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　2.2分別應(yīng)用qRT-PCR和WesternBlot方法檢測兩種細(xì)胞株中CACNA1C基因和蛋白的表達(dá)量。
　　2.3利用Indo1-AM流式細(xì)胞儀檢測利妥昔單抗加或不加鈣通道阻滯劑尼莫地平作用于兩種細(xì)胞系，鈣離子內(nèi)流情況。
　　2.4AnnexinV-FITC流式檢測利妥昔單抗和表阿霉素作用于兩種細(xì)胞

6、株的凋亡率，以及尼莫地平對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果所用到的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)來表示，分別檢驗(yàn)其正態(tài)性、方差齊性，采用t檢驗(yàn)來比較差異。
　　結(jié)果
　　1.CACNA1C基因在敏感組患者中表達(dá)量高于耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.025)。CACNA1C蛋白在耐藥組患者中表達(dá)陽性率較敏感組低(10/22vs31/41，p=

7、O.021)，CD20在兩組中表達(dá)無明顯差異。
　　2.利妥昔單抗和表阿霉素分別作用兩種細(xì)胞株后，細(xì)胞增殖抑制率均呈濃度依賴性，和時(shí)間相關(guān)性不大，最佳作用濃度分別為利妥昔單抗50μg/ml，表阿霉素濃度50ng/ml。
　　3.在對(duì)利妥昔單抗敏感的細(xì)胞株OCI-Ly7中，CACNA1C基因的表達(dá)量明顯高于對(duì)利妥昔單抗耐藥的OCI-Ly3細(xì)胞株(19.617±1.627vs5.230-±0.120，P=0.001)。Weste

8、rnblot發(fā)現(xiàn)鈣通道蛋白CACNA1C在OCI-LY3細(xì)胞上的表達(dá)明顯低于OCI-Ly7細(xì)胞。
　　4.利妥昔單抗聯(lián)合Fab抗體后能誘導(dǎo)兩種細(xì)胞株的鈣內(nèi)流，且鈣內(nèi)流的強(qiáng)度能顯著地被尼莫地平所抑制，對(duì)OCI-Ly7細(xì)胞的抑制強(qiáng)度明顯強(qiáng)于OCI-Ly3細(xì)胞。
　　5.利妥昔單抗處理兩種細(xì)胞株48h，OCI-Ly7細(xì)胞較之OCI-Ly3細(xì)胞有較高的凋亡率;經(jīng)利妥昔單抗聯(lián)合表阿霉素處理48h后，尼莫地平能顯著降低兩種細(xì)胞株的凋亡: