PSMA在肺癌表達(dá)及免疫治療臨床應(yīng)用價值的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　研究前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)在肺癌組織的腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)情況。分析PSMA在肺癌中表達(dá)情況與患者的年齡、性別、病理類型、腫瘤大小、臨床分期等因素的關(guān)系。構(gòu)建AAV/PSMA質(zhì)粒，制備AAV/PSMA病毒，用AAV/PSMA病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)生成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
　　研究方法:
　　1.從天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫

2、瘤醫(yī)院標(biāo)本庫選取非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本87例（包括鱗癌30例、腺癌29例、大細(xì)胞癌28例），小細(xì)胞肺癌30例，正常肺組織標(biāo)本33例。這些標(biāo)本同時用PSMA抗體和CD31抗體進(jìn)行了免疫組化。免疫組化的陽性對照選擇前列腺癌組織，陰性對照選用PBS。
　　2.復(fù)蘇培養(yǎng)擴(kuò)增高表達(dá)目的基因PSMA的LNcap細(xì)胞。用Trizol法從高表達(dá)目的基因的LNcap細(xì)胞中提取總RNA。用mRNA抽提試劑盒從總RNA中抽提mRNA。RT-PCR方法將mRN

3、A逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。利用QIAGEN公司的凝膠抽提試劑盒抽提凝膠中的目的基因。用T4連接酶將目的基因與腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化和涂菌。挑選生長良好的單克隆菌落用LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。單克隆菌落擴(kuò)增之后進(jìn)行質(zhì)粒抽提。抽提的AAV/PSMA質(zhì)粒分別用PCR和基因測序兩種方法進(jìn)行驗證并與GenBank公開的PSMA序列對比吻合。無腺病毒參與的包裝系統(tǒng)制備AAV/PSMA病毒。

4、r>　　3.AAV/PSMA轉(zhuǎn)染DC并誘導(dǎo)生成CTL
　　取健康人外周血，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個核細(xì)胞PBMC。取無菌10cm培養(yǎng)皿，按約8×107～12×107個細(xì)胞/皿，將PBMC加入培養(yǎng)皿中，補充AIM-V培養(yǎng)液。置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，37℃，5％CO2，3小時。3小時后加入AAV/PSMA病毒，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。8小時后將懸浮的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T75或以上的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。根據(jù)懸浮細(xì)胞密度，決定需要培養(yǎng)液體積和細(xì)

5、胞培養(yǎng)瓶的數(shù)量。培養(yǎng)瓶中加入細(xì)胞因子白介素-2，置二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃，5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞。培養(yǎng)皿中加入AIM-V培養(yǎng)基、重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素-4。第六天將DC和淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)（DC∶淋巴細(xì)胞為1∶20）?；旌吓囵B(yǎng)階段應(yīng)每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落情況，若觀察到細(xì)胞集落稍有松散，則可判定細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)已經(jīng)被激活，CTL細(xì)胞培養(yǎng)完成。
　　流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)

6、胞的表型CD83、CD80和CD86; CTL抗腫瘤殺傷活性的檢測:用帶熒光標(biāo)記的CD4、CD8、CD25、CD69抗體標(biāo)記CTL細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，得到所培養(yǎng)的CTL細(xì)胞中CD4+CD8+、CD25+CD4+、CD69+CD8+的表達(dá)情況;用FITC-anti-IFN-γ標(biāo)記CTL，以流式細(xì)胞儀檢測，得到CTL細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)情況。用不同MOI的病毒轉(zhuǎn)染DC并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，得到AAV/PSMA病毒轉(zhuǎn)染DC的最佳M

7、OI數(shù)值。
　　研究結(jié)果：
　　1.在非小細(xì)胞肺癌中，PSMA在腫瘤細(xì)胞上的陽性表達(dá)率為54.02％，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的陽性表達(dá)率為85.06％;在小細(xì)胞肺癌中，腫瘤細(xì)胞上沒有PSMA陽性表達(dá)，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上PSMA陽性表達(dá)率為73.33％;在與腫瘤相鄰的正常肺組織上沒有發(fā)現(xiàn)PSMA表達(dá)。
　　2.成功構(gòu)建AAV/PSMA質(zhì)粒并制備AAV/PSMA病毒;經(jīng)PCR驗證，構(gòu)建的質(zhì)粒中成功插入PSMA基因，長度為7

8、20bp;樹突狀細(xì)胞中CD80、 CD83和CD86的表達(dá)比例分別為54％、83％和72％; CTL中CD8/CD4為1.12，CD25+CD4+、CD69+CD8+和IFN-γ的表達(dá)分別為9.052％、42.76％和39％。
　　研究結(jié)論：
　　PSMA特異性的表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌的腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞;PSMA特異性表達(dá)于小細(xì)胞肺癌的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞而不表達(dá)于腫瘤細(xì)胞;與腫瘤相鄰的正常肺組織無PSMA表達(dá);PSMA可能成