新生大鼠高氧性肺損傷肺組織中AQPl、α-ENaC、SP-A的蛋白和mRNA表達及呋塞米霧化的干預作用.pdf

1、目的:
　　1.建立新生大鼠高氧肺損傷的動物模型;
　　2.觀察和比較高氧性肺損傷時實驗動物肺組織病理學改變,以及水通道蛋白-I(AQPl)、鈉通道(α-ENaC)、肺表面活性物質(zhì)相關蛋白A(SP-A)的mRNA及其蛋白的表達變化,從而探討AQPK a-ENaC、SP-A在急性高氧性肺損傷發(fā)病機制中的作用;
　　3.探討呋塞米霧化是否通過調(diào)控AQPI、α-ENaC、SP-A的表達從而發(fā)揮對高氧肺損傷的保護作用,為臨床防

2、治高氧性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　方法:將110只出生一天內(nèi)的新生Sprague Dawiey(SD)大鼠(雌雄不限)隨機分為三組:I組:空氣組(對照組,n=37);Ⅱ組:高氧組(高氧+生理鹽水霧化, n=37);Ⅲ組:干預組(高氧+呋塞米霧化,n=36)。
　　Ⅰ組新生大鼠置于空氣中飼養(yǎng)。Ⅱ組、Ⅲ組新生大鼠置于氧濃度維持在95％左右的氧箱中飼養(yǎng)。Ⅲ組于實驗第一天起霧化吸入呋塞米(lmg/kg, qod),兩天一次,共計七次

3、。II組于實驗第一天起同時間點霧化等量生理鹽水。
　　每組按實驗時間點分為3天、7天、14天三個亞組,并于各實驗時間點隨機取實驗動物十二只,處死取材檢測以下指標:
　　(1)肺泡灌洗液中總蛋白含量;
　　(2)左肺稱取濕、干重,計算肺濕/干重比值;
　　(3)右上肺行病理切片后,觀察肺組織病理改變;
　　(4)肺組織AQPl, α-ENaC, SP-A蛋白及mRNA含量測定:取相應肺組織提取蛋白,通過Wes

4、tern Blotting方法測定其蛋白含量;另外取相應肺組織提取RNA,通過RT-PCR方法測定m RNA表達水平。
　　結果:1.各組實驗動物一般情況觀察:Ⅰ組(空氣組)中的實驗動物反應好,生長發(fā)育正常。Ⅱ組(高氧組)中的實驗動物逐漸出現(xiàn)癥狀,表現(xiàn)為皮毛無光澤,精神反應欠佳,脫氧后煩躁不安,呼吸困難明顯,唇周發(fā)紺,其中一只實驗動物死亡。而Ⅲ組(干預組)中的實驗動物一般活動情況較高氧組明顯改善,實驗動物無死亡。
　　2.肺

5、組織病理學改變:Ⅰ組(空氣組)實驗動物各時間點肺組織肺泡大小均一,肺泡腔內(nèi)未及液體滲出、細胞浸潤。Ⅱ組(髙氧組)實驗動物在高氧暴露3天后,肺泡腔擴大,肺血管擴張充血,肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紅細胞、炎性細胞浸潤。7天后可見肺組織水腫,結構紊亂,肺泡內(nèi)出血、液體滲出、炎癥細胞浸潤明顯加重,部分肺間隔增寬變形,肺組織結構紊亂。14天時更為明顯,肺組織結構紊亂,肺間隔明顯增厚,出現(xiàn)纖維化表現(xiàn),肺泡數(shù)量明顯減少,肺泡腔明顯增大,可見肺大泡。Ⅲ組(干預組)肺

6、組織各時相形態(tài)與結構改變均較高氧組明顯減輕。
　　3.肺組織濕/干重比(W/D):在實驗3天、7天、14天時, Ⅱ組(高氧組)實驗動物肺組織W/D較I組(空氣組)有升髙(P<0.05),而Ⅲ組(干預組)實驗動物肺組織W/D較I I組(高氧組)明顯降低(PC0.05)。
　　4.支氣管肺泡灌洗液(BLAF)中總蛋白(TP)含量測定:在實驗3天、7天、14天時, Ⅱ組(高氧組)實驗動物的BLAF中TP含量明顯高于Ⅰ組(空氣對照組

7、)(P<0.05),Ⅲ組(干預組)的BLAF中TP含量則明顯低于II組(高氧組)(<0.05)。
　　5.肺組織中AQP1,α-ENaC, SP-A蛋白表達水平的變化:
　　(1)在實驗第3天、7天時,Ⅱ組(高氧組)肺組織AQPl蛋白表達水平較I組(空氣組)下降明顯(P<0.01),14天時Ⅱ組(高氧組)肺組織AQPl的蛋白表達水平較前增加,但較Ⅰ組(空氣組)仍有下降(p<0.055)。m組(干預組)肺組織AQPl蛋白表達水

8、平在實驗3天、7天及14天時均與Ⅰ組(空氣組)接近,明顯高于Ⅱ組(高氧組),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(2)在實驗第3天、7天及14天時,Ⅱ組(高氧組)肺組織Oi-ENaC的蛋白表達水平較I組(空氣組)明顯下降(P<0.05),而m組(干預組)肺組織a-ENaC蛋白表達水平較Ⅱ組(高氧組)明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(3)在實驗第3天時,Ⅱ組(髙氧組)肺組織SP-A蛋白表達水平較I(空

9、氣組)及Ⅲ組(干預組)明顯升高(P<0.05),在實驗第7天、14天時表達較I(空氣組)及Ⅲ組(干預組)明顯下降(P<0.05),而Ⅲ組(干預組)肺組織SPA蛋白表達水平與I組(空氣組)接近,兩者無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　6.肺組織中AQPl, α-ENaC, SP-A的mRNA表達水平的變化:在本實驗中,通過RT-PCR方法檢測顯示:
　　(1)在實驗第3天、7天及14天時,Ⅱ組(高氧組)肺組織AQPl及αa-E

10、NaC的mRNA表達水平均較I組(空氣組)明顯下降(P<0.05),Ⅲ組(干預組)肺組織AQPi及α-ENaC的mRNA表達水平稍低于I組(空氣組)(p>0.05),明顯高于Ⅱ組(髙氧組),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺組織中AQPl的mRNA表達水平與α-ENaC的m R N A表達行相關性分析,提示兩者呈正相關關系,直線等級相關系數(shù)為0.451(p<0.01)。
　　(2)在實驗第3天時,Ⅱ組(高氧組)肺組織中SP-A的

11、mRNA表達水平較I組(空氣組)明顯升高(P<0.05),在實驗第7天、14天時Ⅱ組(高氧組)肺組織中SP-A的mRNA表達水平較I組(空氣組)明顯下降(P　　結論:1.暴露于高氧中可致新生大鼠發(fā)生肺損傷,并隨暴露時間的延長肺損傷

12、漸加重。主要病理表現(xiàn)為肺組織水腫、結構紊亂、肺泡內(nèi)出血、炎性細胞浸潤,肺泡數(shù)目減少,肺泡間隔增厚及纖維化等。
　　2.高氧性肺損傷時,AQPl及 a-ENaC的蛋白及mRNA的表達水平較正常對照組中相應蛋白及mRNA的表達水平下降,與肺水腫的程度相一致,提示AQPl、α-ENaC的蛋白及mRNA的表達水平的變化在急性高氧性肺損傷的肺水腫的形成中起著重要作用。
　　3.高氧性肺損傷時,SP-A蛋白及m RNA表達水平呈先增高后