“同病異治”復(fù)方對(duì)戊四氮慢性點(diǎn)燃大鼠腦區(qū)興奮性及海馬區(qū)谷氨酸代謝通路的影響.pdf

1、一、研究背景
　　 癲癇是一組由大腦神經(jīng)元反復(fù)異常同步化放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。1997年WHO統(tǒng)計(jì)報(bào)告,癲癇的患病率在發(fā)達(dá)國(guó)家、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)軌國(guó)家、發(fā)展中國(guó)家和不發(fā)達(dá)國(guó)家分別為5.0‰、6.1‰、7.2‰、11.2‰,估計(jì)全球有約5000萬(wàn)癲癇患者。據(jù)2000年國(guó)內(nèi)5省癲癇流行病學(xué)抽樣調(diào)查表明:我國(guó)癲癇患病率為7.0‰,活動(dòng)性癲癇患病率為4.6‰,以此推算,全國(guó)約有活動(dòng)性癲癇患者500～600萬(wàn)。<

2、br>　　 臨床常用的抗癲癇藥如苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平、乙虎胺等一直是治療癲癇的主要藥物,但其藥代動(dòng)力學(xué)的局限性、致畸的可能性、對(duì)骨密度的影響、以及對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生的不良作用等因素,影響了治療的依從性,另外尚有20％左右的頑固性癲癇藥物難以控制,對(duì)手術(shù)治療、物理治療和心理治療均耐受,這就需要研發(fā)新的抗癲癇藥物。中醫(yī)藥治療癲癇歷史久遠(yuǎn),療效確切,副作用較少,有一定的優(yōu)勢(shì),多種經(jīng)方、驗(yàn)方臨床療效可觀。
　　 癲癇的發(fā)作類(lèi)型多,

3、發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,而借助實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立能夠模擬人類(lèi)癲癇發(fā)作的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇模型,探討癲癇的發(fā)病機(jī)制已成為當(dāng)前本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。PTZ慢性點(diǎn)燃模型是國(guó)際公認(rèn)的癲癇模型之一,該模型是強(qiáng)直陣攣發(fā)作的代表模型,可用于研究藥物的效應(yīng),較為客觀地反映藥物的抗癲癇作用。
　　 神經(jīng)元興奮性增高和過(guò)度同步化電發(fā)放是產(chǎn)生癲癇的基本條件,癲癇發(fā)生的機(jī)制之一可能與樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抑制性氨基酸能神經(jīng)元的興奮性下降、興奮性氨基酸能神經(jīng)元的興奮性升高有關(guān),腦內(nèi)

4、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)過(guò)度積聚能導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加,進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損害,谷氨酸(Glutamate,Glu)和天門(mén)冬氨酸(Aspartic acid,Asp)是腦內(nèi)興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大腦的能量代謝與腦的各處功能活動(dòng)有著密切的關(guān)系,癲癇灶局部大腦葡萄糖代謝相對(duì)發(fā)作間期均呈明顯相對(duì)高代謝。
　　 Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),突觸間隙內(nèi)Glu過(guò)度聚集會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加及神經(jīng)毒性,是癲

5、癇發(fā)作的機(jī)制之一,并且癲癇發(fā)作過(guò)程中局部Glu繼續(xù)積聚將進(jìn)一步加重神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損害。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(Glutamate transporter,GLT-1)是一種膠質(zhì)細(xì)胞型谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,能將突觸間隙內(nèi)90％的Glu攝入局部膠質(zhì)細(xì)胞,起著谷氨酸泵的作用,攝入到膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的Glu經(jīng)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)催化,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺(glutamine,Gln),解除Glu的興奮性毒性作用,后者重新

6、回到突觸前神經(jīng)元,在神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺酶的作用下轉(zhuǎn)化為Glu,參與其再循環(huán)。
　　 “同病異治”是中醫(yī)辨證論治的特色之一,癲癇屬于中醫(yī)“癇病”范疇,其辨證論治亦存在不同的治法,根據(jù)病因病機(jī),中醫(yī)論治癲癇涉及“從痰論治”和“從肝論治”等治法,為了探討兩種治法復(fù)方對(duì)同一類(lèi)癲癇發(fā)作的作用特點(diǎn)及機(jī)制是否存在差異,本研究選用大鼠PTZ慢性點(diǎn)燃模型,用“從痰論治”癲癇的復(fù)方定癇丸以及“從肝論治”癲癇的復(fù)方柴胡疏肝湯進(jìn)行干預(yù),觀察并比較了兩種復(fù)

7、方作用下大鼠的癇性發(fā)作情況,及其對(duì)癲癇大鼠皮層、海馬(不同腦區(qū))葡萄糖代謝水平、興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平及海馬區(qū)Glu代謝通路的影響,探討兩種治法復(fù)方的抗癲癇作用及機(jī)制是否存在差異。
　　 二、方法與內(nèi)容
　　 1.PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠模型的建立
　　 Wistar大鼠150只,隨機(jī)選取9只空白對(duì)照組,余大鼠以PTZ35mg/kg每日腹腔注射1次,空白組大鼠每日腹腔注射等體積生理鹽水,連續(xù)注射21天。按照Raci

8、ne癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),評(píng)價(jià)其癇性發(fā)作級(jí)別,選取在18±3天內(nèi)至少連續(xù)3次達(dá)4級(jí)或4級(jí)以上發(fā)作的大鼠,間歇1周后再次以相同劑量PTZ腹腔注射,癇性發(fā)作仍能達(dá)到4級(jí)或4級(jí)以上的大鼠被認(rèn)為是點(diǎn)燃成功大鼠。
　　 2.兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠癇性發(fā)作及腦電圖的影響
　　 點(diǎn)燃成功的大鼠60只,隨機(jī)分為6組,分別為生理鹽水組(A組；生理鹽水2ml/次灌胃)、VPA組(B組；VPA混懸液200mg/kg·d灌胃)、定癇丸組(C組；

9、定癇丸水煎液12g/kg·d灌胃)、柴胡疏肝湯高劑量組(D組；柴胡疏肝湯水煎液10g/kg·d灌胃)、柴胡疏肝湯中劑量組(E組；柴胡疏肝湯水煎液5g/kg·d灌胃)及柴胡疏肝湯低劑量組(F組；柴胡疏肝湯水煎液2.5g/kg·d灌胃),各組大鼠均連續(xù)給藥28天。于灌胃給藥第7天、14天、21天及28天再次以PTZ35mg/kg腹腔注射1次,觀察大鼠癇性發(fā)作情況,按照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察并比較各組大鼠陣發(fā)性痙攣潛伏期(即從注射PTZ開(kāi)始

10、至3級(jí)發(fā)作的時(shí)間)、癇性發(fā)作級(jí)別,并計(jì)算各組大鼠強(qiáng)直性驚厥(5級(jí))發(fā)作率。于灌胃給藥第14天、28天時(shí)各組同時(shí)均隨機(jī)抽取2只大鼠用16道生理信號(hào)采集系統(tǒng)進(jìn)行腦電圖描記。
　　 3.兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠不同腦區(qū)興奮性的影響
　　 點(diǎn)燃成功的大鼠54只,隨機(jī)分為6組,分別為模型組(B組；生理鹽水2ml/次灌胃)、VPA組(C組；VPA混懸液200mg/kg·d灌胃)、定癇丸組(D組；定癇丸水煎液12g/kg·d 灌胃)

11、、柴胡疏肝湯高劑量組(E組；柴胡疏肝湯水煎液10g/kg·d)、柴胡疏肝湯中劑量組(F組；柴胡疏肝湯水煎液5g/kg·d)及柴胡疏肝湯低劑量組(G組；柴胡疏肝湯水煎液2.5g/kg·d),同批9只正常大鼠為空白對(duì)照組(A組,生理鹽水2ml/次灌胃),連續(xù)給藥28天。于給藥第28天8am給藥1.5h后各組隨機(jī)選取6只大鼠,再次以PTZ35mg/kg腹腔注射,A組腹腔注射等體積生理鹽水,行為學(xué)觀察10min后,10％水合氯醛麻醉下,冰上斷頭

12、取腦,分離皮層、海馬,-80。C凍存?zhèn)溆谩?br>　　 3.1兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠不同腦區(qū)葡萄糖代謝的影響
　　 應(yīng)用熒光成像技術(shù)檢測(cè)不同腦區(qū)內(nèi)2-NBDG含量。于給藥第28天,各組隨機(jī)選取3只大鼠給藥1h后尾靜脈注射0.1mg/0.1ml的2-NBDG 0.2ml,30min后PTZ35mg/kg再次腹腔注射,A組腹腔注射等體積生理鹽水,麻醉后開(kāi)胸,先后以冰生理鹽水及4％多聚甲醛灌注固定,參照《大鼠腦立體定位圖譜》(G

13、eorgePaxinos著,人民衛(wèi)生出版社)于冰凍切片機(jī)上切取冠狀面腦片,片厚500μm,于熒光活體成像儀上在激發(fā)光475nm,發(fā)射光550nm條件下熒光成像,圖像采用綁定的圖像分析軟件分析,每只大鼠選取2張切片進(jìn)行分析,按照公式V/B=(左側(cè)皮層或海馬ROI的平均灰度+右側(cè)皮層或海馬ROI的平均灰度)/整個(gè)大腦切面ROI的平均灰度,計(jì)算V/B的值。
　　 3.2兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠不同腦區(qū)內(nèi)Glu、Asp含量的影響

14、>　　 應(yīng)用HPLC檢測(cè)癲癇大鼠不同腦區(qū)內(nèi)Glu、Asp含量。精確稱(chēng)取各組大鼠皮層組織及海馬組織,放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中,以1:4(w/v)比例加入80％乙醇冰上勻漿,勻漿液離心后上清液轉(zhuǎn)入燒杯,燒杯置于800C恒溫水浴中蒸干后,加入0.1mol/1鹽酸溶液超聲溶解殘?jiān)?溶解液移入5ml定溶瓶并定溶,抽取一定量HCL混合物離心后,上清液經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾至液相樣品瓶,于高效液相色譜儀上檢測(cè)Glu及Asp含量,每組檢測(cè)6次。

15、>　　 4.兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠海馬區(qū)Glu代謝通路的影響
　　 點(diǎn)燃成功的大鼠54只,隨機(jī)分為6組,分別為模型組(B組；生理鹽水2ml/次灌胃)、VPA組(C組；VPA混懸液200mg/kg·d灌胃)、定癇丸組(D組；定癇丸水煎液12g/kg·d灌胃)、柴胡疏肝湯高劑量組(E組；柴胡疏肝湯水煎液10g/kg·d)、柴胡疏肝湯中劑量組(F組；柴胡疏肝湯水煎液5g/kg·d)及柴胡疏肝湯低劑量組(G組;柴胡疏肝湯水煎液2.

16、5g/kg·d),同批9只正常大鼠為空白對(duì)照組(A組,生理鹽水2ml/次灌胃),連續(xù)給藥28天。于給藥第28天8am給藥1.5h后各組隨機(jī)選取6只大鼠,再次以PTZ35mg/kg腹腔注射,A組腹腔注射等體積生理鹽水,10％水合氯醛麻醉后,冰上斷頭取腦,分離皮層、海馬,-80℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 4.1兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠海馬區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　 4.2兩復(fù)方對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠海馬區(qū)GS活性的影響

17、　　 5.統(tǒng)計(jì)方法
　　 三、結(jié)論
　　 1.癲癇“從肝論治”的復(fù)方柴胡疏肝湯、“從痰論治”的復(fù)方定癇丸均能明顯抑制PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠的癇性發(fā)作,抑制癲癇大鼠腦內(nèi)癇性波的發(fā)放,有明顯的抗癲癇作用；
　　 2.癲癇“從肝論治”的復(fù)方柴胡疏肝湯、“從痰論治”的復(fù)方定癇丸均能降低PTZ致癇大鼠不同腦區(qū)興奮性,通過(guò)降低不同腦區(qū)內(nèi)Glu及Asp的含量,可能是兩復(fù)方降低不同腦區(qū)興奮性從而達(dá)到抗癲癇作用的機(jī)制之一,但兩復(fù)方對(duì)

18、不同腦區(qū)內(nèi)Glu及Asp的含量的影響存在差異；
　　 3.癲癇“從肝論治”的復(fù)方柴胡疏肝湯、“從痰論治”的復(fù)方定癇丸均能升高海馬區(qū)GLT-1蛋白的表達(dá)及GS的活性,影響Glu的代謝通路,從而達(dá)到降低海馬突觸間隙內(nèi)Glu含量,解除其神經(jīng)毒性作用,但兩復(fù)方對(duì)該通路中GS活性的影響存在差異；
　　 4.綜上所述,癲癇“從肝論治”的復(fù)方柴胡疏肝湯、“從痰論治”的復(fù)方定癇丸均有較好的抗癲癇作用,但兩復(fù)方對(duì)腦內(nèi)Glu含量的影響及對(duì)G