人參皂苷調(diào)控植物干細(xì)胞活性和端粒長(zhǎng)度的研究.pdf

1、中藥資源研究的一個(gè)重要目標(biāo)就是培育品質(zhì)優(yōu)良的中藥材。對(duì)于植物藥來(lái)說(shuō)，藥效成分主要來(lái)自于植物自身所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。因此，在中藥材研究及實(shí)際生產(chǎn)中常實(shí)施多種策略來(lái)增加體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累以提高藥材品質(zhì)。在關(guān)注植物中次生代謝產(chǎn)物為人類所用的同時(shí)，卻很少關(guān)注這些化學(xué)成分的產(chǎn)生對(duì)植物本身的意義。
　　人參為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根狀莖，在我國(guó)有上千年的用藥歷史，是我國(guó)臨床應(yīng)用最廣

2、泛的的中藥材之一。由于人參有著獨(dú)特的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，能達(dá)幾十年甚至上百年的生長(zhǎng)周期，且其次生代謝產(chǎn)物人參皂苷有著廣泛的藥理活性，為比較理想的研究材料。因此，本論文以名貴中藥材人參為研究對(duì)象，初步探索人參中人參皂苷的生理功能。
　　人參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效。人參中的主要有效成分人參皂苷是一類具有達(dá)瑪烷型或齊墩果烷型結(jié)構(gòu)的三萜類合物。藥理學(xué)研究表明，人參皂苷具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、心

3、血管系統(tǒng)，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)，抗腫瘤，增強(qiáng)人體免疫力等生物學(xué)活性，為人參治療心腦血管疾病和抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。人參皂苷的含量會(huì)隨著人參生長(zhǎng)年限的增加而增多。因此，一般認(rèn)為，人參越“老”，人參皂苷含量越多，其品質(zhì)也越好。近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷對(duì)人體多種干細(xì)胞的增殖、分化、損傷修復(fù)及延緩端?？s短等方面都具有調(diào)控作用，這為人參調(diào)控人體機(jī)能，延緩衰老的功效提供了科學(xué)依據(jù)。
　　一般認(rèn)為次生代謝產(chǎn)物在植物適應(yīng)環(huán)境，克服外界環(huán)境壓力和化學(xué)

4、防御中發(fā)揮著重要作用，但越來(lái)越多的研究顯示，這些化學(xué)成分對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育也會(huì)產(chǎn)生重要影響，是植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中不可缺少的一部分。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，會(huì)受到多種因素的影響，如外部的各種環(huán)境因子、生物因素，內(nèi)部的遺傳特性、相關(guān)的調(diào)控因子、活性氧、內(nèi)源激素、干細(xì)胞、端粒等，其中位于植物根尖和莖尖的于細(xì)胞，能不斷進(jìn)行自我更新并持續(xù)分裂，修復(fù)和更新?lián)p傷的細(xì)胞，而且能根據(jù)內(nèi)部和外界環(huán)境信號(hào)來(lái)決定植物器官的發(fā)生、生殖生長(zhǎng)、衰老等，從而使生長(zhǎng)上百年甚

5、至上千年的植物一直保持新生活力。端粒作為染色體末端的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，在DNA復(fù)制時(shí)丟失自己的堿基以保護(hù)DNA復(fù)制的完整和穩(wěn)定。當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到一定程度，細(xì)胞就停止分裂，逐漸衰老死亡。因此，端粒對(duì)維持染色體的穩(wěn)定和細(xì)胞分裂能力具有重要作用，也成為DNA的“年輪”和分子鐘，在一定程度上反映生物個(gè)體的年齡水平。人參皂苷為人參所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人和動(dòng)物的干細(xì)胞和端粒長(zhǎng)度的調(diào)控有著重要的影響，且動(dòng)物和植物有相似的干細(xì)胞調(diào)控行為，而植物干細(xì)胞和

6、端粒在植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老等生物學(xué)過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。因此，基于以上研究基礎(chǔ)，本論文將通過(guò)研究人參皂苷對(duì)植物干細(xì)胞和端粒的影響，來(lái)揭示人參生長(zhǎng)發(fā)育中人參皂苷的生理生化功能。通過(guò)研究，為初步揭示人參的生長(zhǎng)機(jī)制提供參考，同時(shí)也為藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生理功能研究提供新的研究思路和方法。
　　基于以上研究認(rèn)識(shí)，本論文開展了如下工作:
　　1、人參皂苷含量隨年限的變化規(guī)律研究
　　采用UPLC-MS的方法對(duì)1～13年人參中的

7、8種主要人參皂苷成分（人參皂苷-Rg1、Re、Rb1、Rb2、 Rc、Rd、Rf、Ro）進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)人參總皂苷在人參不同藥用部位中的含量差異較為明顯。人參葉中的人參皂苷成分含量最高，其總皂苷含量隨生長(zhǎng)年限變化波動(dòng)較大，在13年內(nèi)總皂苷含量由36.64 mg/g升高到59.03 mg/g，人參皂苷積累增加較為明顯;蘆頭中皂苷含量較葉低，其中2-7年生人參的蘆頭中總皂苷在23.09～31.88 mg/g范圍內(nèi)波動(dòng)，含量相對(duì)穩(wěn)定，而在第

8、8年生時(shí)蘆頭中皂苷積累量迅速增加至43.92 mg/g，隨后3年含量基本保持不變(39.56～40.83 mg/g)，當(dāng)生長(zhǎng)至第12、13年時(shí)，蘆頭中皂苷含量又迅速升高（58.73 mg/g、65.30 mg/g）;人參主根中皂苷含量最低，隨年限增加呈現(xiàn)平穩(wěn)升高的趨勢(shì)，在13年內(nèi)人參皂苷積累量增加約1倍(16.27 mg/g～31.14 mg/g)。
　　研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷單體成分在不同部位中的分布也不同，其中人參皂苷Rg1和R

9、e在人參葉中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成分，但在主根和蘆頭中含量卻低于人參皂苷Rb1;齊墩果烷型人參皂苷Ro在3個(gè)藥用部位中含量差異不明顯，且均隨年限延長(zhǎng)而積累量逐漸增加;人參皂苷在根皮中積累量最多，形成層和韌皮部的人參皂苷含量次之，木質(zhì)部中皂苷的含量是最少，且根皮中人參皂苷含量是其他組織中的2倍以上。
　　2、影響擬南芥根尖干細(xì)胞分裂的人參皂苷成分的篩選研究
　　在細(xì)胞分裂活躍的根尖分生組織的頂端，由一群快速分裂的不同類型的干細(xì)胞

10、圍繞著一團(tuán)分裂活性極低的細(xì)胞（靜止中心）共同組成根尖干細(xì)胞微環(huán)境的組織結(jié)構(gòu)。由于人參的全基因組序列還未完全被解析，干細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)研究處于空白狀態(tài)，模式植物擬南芥有著相對(duì)清晰的干細(xì)胞調(diào)控研究體系。因此，選擇在擬南芥體系中篩選出對(duì)植物干細(xì)胞有影響的人參皂苷成分。
　　結(jié)合人參皂菅不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和含量變化規(guī)律，以原人參二醇類成分中含量最多的人參皂苷Rb1及其皂苷元20(S)原人參二醇，原人參三醇類成分中含量最多的人參皂苷Rg1、

11、Re及其皂苷元20(S)原人參三醇和齊墩果烷型人參皂苷Ro等6個(gè)代表性成分進(jìn)行篩選。在含有50、100、150μM人參皂苷成分的1/2 MS培養(yǎng)基中分別播種野生型擬南芥種子（Col-0型），發(fā)現(xiàn)這些成分的加入對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)沒(méi)有影響，但對(duì)其幼苗初生根長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，且具有濃度依賴性，其中以人參皂苷中的某一成分GS1抑制根長(zhǎng)作用最為顯著;在組織水平觀察根尖分生區(qū)，發(fā)現(xiàn)分生區(qū)范圍的縮小與抑制根長(zhǎng)的趨勢(shì)具有一致性;在分子水平上GUS

12、染色觀察分生區(qū)細(xì)胞分裂活性，發(fā)現(xiàn)表征細(xì)胞有絲分裂活性的標(biāo)記基因CycB1;1∶GUS的染色區(qū)域與抑制根長(zhǎng)程度也較為一致，其中仍以GS1的作用最為明顯，染色區(qū)域最少。
　　隨后選擇100μM GS1處理熒光標(biāo)記靜止中心(WOX5∶GFP; QC184∶GUS)及根冠干細(xì)胞(J2341∶GFP)區(qū)域的擬南芥材料。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，GS1的加入能促使根尖靜止中心WOX5基因表達(dá)的熒光區(qū)域擴(kuò)展，靜止中心報(bào)告基因Q

13、C184的GUS染色區(qū)域也部分?jǐn)U增，預(yù)示著靜止中心細(xì)胞發(fā)生了分裂;同時(shí)標(biāo)記根冠干細(xì)胞的報(bào)告基因J2341的熒光區(qū)域也發(fā)生了擴(kuò)展，表征根冠干細(xì)胞發(fā)生了分裂。通過(guò)對(duì)PLT1/2及SCR/SHR兩個(gè)主要的干細(xì)胞調(diào)控通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GS1的加入并不能影響相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)建立和維持干細(xì)胞微環(huán)境的生長(zhǎng)素的濃度梯度也未發(fā)生較大的改變。
　　研究結(jié)果表明，人參皂苷類成分對(duì)擬南芥初生根長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，這種作用是通過(guò)抑制根尖分

14、生區(qū)細(xì)胞分裂活性導(dǎo)致分生區(qū)范圍縮小而實(shí)現(xiàn)的; GS1能強(qiáng)烈抑制擬南芥初生根長(zhǎng)，但同時(shí)卻能促使其局部區(qū)域—根尖干細(xì)胞中心發(fā)生活動(dòng)，靜止中心和根冠干細(xì)胞均發(fā)生了細(xì)胞分裂。因此，GS1不但能對(duì)擬南芥初生根長(zhǎng)的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，同時(shí)也能影響根尖干細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)，促使根尖干細(xì)胞和靜止中心同時(shí)發(fā)生分裂，調(diào)控根尖干細(xì)胞的活性，但其作用機(jī)制還不清楚。因此，為闡明GS1對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的作用機(jī)制，需通過(guò)正向遺傳學(xué)方法運(yùn)用遺傳篩選和圖位克隆的手段找到其作用基

15、因。
　　3、GS1對(duì)擬南芥根長(zhǎng)影響的遺傳篩選及圖位克隆研究
　　在含有100μM GS1的1/2 MS培養(yǎng)基上播種EMS誘變的約980個(gè)編號(hào)的擬南芥突變體群，從中篩選出對(duì)GS1不敏感的突變體即根長(zhǎng)較長(zhǎng)的種子，并移于土中收種再進(jìn)行驗(yàn)證。在初次篩出的12個(gè)突變體材料中最終經(jīng)過(guò)第二代種子驗(yàn)證確定編號(hào)為14的突變體(Ginsenoside insensitive mutant: gsi)的初生根長(zhǎng)不受GS1的影響，為所需要的陽(yáng)性材

16、料。不斷播種gsi進(jìn)行篩選至純合的種子，將純合的植株與另一生態(tài)型（Ler型）植株進(jìn)行雜交，以突變體F2代雜交種為樣本進(jìn)行圖位克隆，提取約100個(gè)突變體樣品的DNA，以擬南芥5條染色體上22個(gè)SSLP標(biāo)記分子進(jìn)行篩選粗定位，初步確定突變點(diǎn)范圍。在突變位置附近左右分別用1對(duì)引物進(jìn)行篩選，并不斷向內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)引物縮小突變位點(diǎn)的范圍以精細(xì)定位，在經(jīng)過(guò)約2400個(gè)樣品的篩選后，確定突變基因在約60 kb的范圍內(nèi)，在此范圍內(nèi)共包含有10個(gè)基因。為確定突

17、變位點(diǎn)，將10個(gè)基因全部克隆出來(lái)，連接載體測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，序列號(hào)為AT5G20950的基因在其CDS區(qū)發(fā)生了一個(gè)堿基的突變，核苷酸序列由G突變成了A，同時(shí)導(dǎo)致了其氨基酸的變化，由甘氨酸(G)變成了精氨酸(R)，而其他基因核苷酸序列并未發(fā)生改變。通過(guò)與SALK突變體庫(kù)該基因的突變體(SALK_058396C)表型相比較，發(fā)現(xiàn)SALK_058396C的初生根長(zhǎng)也不受GS1的影響，且根長(zhǎng)與所篩到的突變體較為一致。將該基因完整的CDS序列通

18、過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到突變體gsi中進(jìn)行遺傳互補(bǔ)，經(jīng)T2代純合體驗(yàn)證，其表型也得到了恢復(fù)。因此，可確定該基因的突變確能導(dǎo)致對(duì)GS1的不敏感，同時(shí)也證明該基因在GS1抑制擬南芥的根長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。
　　4、GS1作用基因的功能驗(yàn)證研究
　　進(jìn)一步對(duì)突變基因(AT5G20950)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的是一種糖苷水解酶(Glycosyl hydrolase)，因此，將該基因命名為GH。糖苷水解酶蛋白是由625個(gè)氨基酸

19、構(gòu)成，有Glyco_hydro_3和Glyco_ hydro_3C2個(gè)功能保守區(qū)，其中Glyco_hydro_3C在參與催化反應(yīng)及結(jié)合葡萄糖中發(fā)揮重要作用。而所篩選出的突變位點(diǎn)正是在這一重要保守區(qū)內(nèi)，此突變位點(diǎn)的存在可能也是導(dǎo)致其功能缺失的直接原因。為確定該糖苷水解酶是否對(duì)GS1有水解作用，將GH基因連入PMAL載體進(jìn)行蛋白原核表達(dá)。以所得到的蛋白為酶液，NaAC緩沖液(pH5.0)為酶促反應(yīng)液，以GS1為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)。將酶促反應(yīng)產(chǎn)

20、物進(jìn)樣UPLC-Q/TOF-MS分析，發(fā)現(xiàn)加入表達(dá)蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物中有一個(gè)新的產(chǎn)物生成，且這一產(chǎn)物的分子離子質(zhì)量數(shù)（m/z）與GS1相比，丟失了一個(gè)葡萄糖的分子量。將所生成的新產(chǎn)物與另一皂菅成分GS1-1質(zhì)譜信息相比，二者的保留時(shí)間及離子峰均相同;同時(shí)將gsi播種于含有100μM GS1-1的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)gsi表現(xiàn)為與Col-0相似的短根表型，GS1-1嚴(yán)重抑制gsi的初生根長(zhǎng)，可確定GS1水解后的產(chǎn)物為GS1-1。充分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

21、在擬南芥體系中，當(dāng)加入GS1處理后，植物體內(nèi)的糖苷水解酶能水解該成分中的一個(gè)葡萄糖，轉(zhuǎn)化為另外一種人參皂苷GS1-1，從而發(fā)揮抑制初生根長(zhǎng)的作用。
　　5、人參皂苷對(duì)人參端粒長(zhǎng)度的調(diào)控作用研究
　　為進(jìn)一步研究人參皂苷對(duì)人參端粒長(zhǎng)度的調(diào)控作用，采用qPCR(real-timeQuantitative Polymerase Chain Reaction)的方法檢測(cè)了1-6年生人參相對(duì)端粒長(zhǎng)度在不同生長(zhǎng)時(shí)期的變化情況。在主根中，

22、端粒長(zhǎng)度在第1年是較長(zhǎng)的，但隨后會(huì)出現(xiàn)逐漸縮短的趨勢(shì)，在第3、4年端粒長(zhǎng)度達(dá)到最低值，而后又出現(xiàn)逐漸延長(zhǎng)趨勢(shì);人參葉中的端粒長(zhǎng)度隨年限變化趨勢(shì)與主根較為一致。在不同的生長(zhǎng)時(shí)期，端粒長(zhǎng)度變化較大。端粒這種隨年限的變化很有可能與植物自身的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控有關(guān)。中年限（10-14年）和長(zhǎng)年限（15-30年）人參的端粒長(zhǎng)度檢測(cè)顯示，人參的相對(duì)端粒長(zhǎng)度有隨年限增加而呈緩慢延長(zhǎng)的趨勢(shì)。為進(jìn)一步研究同樣隨年限增加的人參皂苷是否對(duì)端粒長(zhǎng)度有影響，在人參懸浮

23、細(xì)胞體系中分別加入不同濃度（5、50、200μM）的3種主要人參皂苷成分—人參皂苷Rg1、Re、Rb1，測(cè)定處理后端粒的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5、50μM濃度下，3種成分均顯示對(duì)人參懸浮細(xì)胞端粒延長(zhǎng)的作用，但在200μM濃度下卻有著輕微縮短端粒長(zhǎng)度的作用，同時(shí)檢測(cè)端粒酶基因均表達(dá)上調(diào)。因此，本部分的研究結(jié)果顯示，人參端粒長(zhǎng)度在1-6年有不穩(wěn)定的變化，但隨著年限的增加，端粒長(zhǎng)度呈逐漸延長(zhǎng)的趨勢(shì)。同時(shí)，隨年限增加積累增多的人參皂苷成分對(duì)自身

24、端粒有一定的延長(zhǎng)作用，且這種作用是通過(guò)激活端粒酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　化學(xué)防御一直被認(rèn)為是植物次生代謝產(chǎn)物的主要生理功能，而本研究揭示，次生代謝產(chǎn)物人參皂苷能通過(guò)調(diào)控植物干細(xì)胞和端粒長(zhǎng)度對(duì)植物的生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生影響。作為小草本植物，人參能有長(zhǎng)達(dá)幾十年的生長(zhǎng)周期，其次生代謝產(chǎn)物人參皂苷隨年限增長(zhǎng)積累增加。端粒作為年齡的生物標(biāo)記，在草本植物人參中發(fā)現(xiàn)，和“長(zhǎng)壽”的木本植物相似，其長(zhǎng)度會(huì)隨生長(zhǎng)年限的增加而延長(zhǎng)，且人參皂苷有助于端粒的這種延長(zhǎng)效

25、應(yīng)。另外，端粒長(zhǎng)度被發(fā)現(xiàn)在植物根尖干細(xì)胞區(qū)域是最長(zhǎng)的，本論文同時(shí)揭示人參皂苷也能對(duì)植物干細(xì)胞產(chǎn)生影響。因此，人參皂苷與植物干細(xì)胞、端粒有著密切的聯(lián)系，通過(guò)相互的影響與調(diào)控共同維持著人參的持續(xù)生長(zhǎng)，在人參的“長(zhǎng)壽”中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　本文在研究思路上，以影響植物生命活力的干細(xì)胞和端粒為切入點(diǎn)，為植物次生代謝產(chǎn)物的生理功能研究提供了新的視角;研究方法上，采用分子遺傳學(xué)的手段闡明了人參中次生代謝產(chǎn)物人參皂苷對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的生理生化