人參皂苷調(diào)控植物干細(xì)胞活性和端粒長度的研究.pdf

1、中藥資源研究的一個重要目標(biāo)就是培育品質(zhì)優(yōu)良的中藥材。對于植物藥來說，藥效成分主要來自于植物自身所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。因此，在中藥材研究及實際生產(chǎn)中常實施多種策略來增加體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累以提高藥材品質(zhì)。在關(guān)注植物中次生代謝產(chǎn)物為人類所用的同時，卻很少關(guān)注這些化學(xué)成分的產(chǎn)生對植物本身的意義。
　　人參為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根狀莖，在我國有上千年的用藥歷史，是我國臨床應(yīng)用最廣

2、泛的的中藥材之一。由于人參有著獨特的生長發(fā)育機制，能達幾十年甚至上百年的生長周期，且其次生代謝產(chǎn)物人參皂苷有著廣泛的藥理活性，為比較理想的研究材料。因此，本論文以名貴中藥材人參為研究對象，初步探索人參中人參皂苷的生理功能。
　　人參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效。人參中的主要有效成分人參皂苷是一類具有達瑪烷型或齊墩果烷型結(jié)構(gòu)的三萜類合物。藥理學(xué)研究表明，人參皂苷具有保護神經(jīng)系統(tǒng)、心

3、血管系統(tǒng)，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)，抗腫瘤，增強人體免疫力等生物學(xué)活性，為人參治療心腦血管疾病和抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。人參皂苷的含量會隨著人參生長年限的增加而增多。因此，一般認(rèn)為，人參越“老”，人參皂苷含量越多，其品質(zhì)也越好。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷對人體多種干細(xì)胞的增殖、分化、損傷修復(fù)及延緩端?？s短等方面都具有調(diào)控作用，這為人參調(diào)控人體機能，延緩衰老的功效提供了科學(xué)依據(jù)。
　　一般認(rèn)為次生代謝產(chǎn)物在植物適應(yīng)環(huán)境，克服外界環(huán)境壓力和化學(xué)

4、防御中發(fā)揮著重要作用，但越來越多的研究顯示，這些化學(xué)成分對植物的生長發(fā)育也會產(chǎn)生重要影響，是植物生長發(fā)育調(diào)控中不可缺少的一部分。植物在生長發(fā)育過程中，會受到多種因素的影響，如外部的各種環(huán)境因子、生物因素，內(nèi)部的遺傳特性、相關(guān)的調(diào)控因子、活性氧、內(nèi)源激素、干細(xì)胞、端粒等，其中位于植物根尖和莖尖的于細(xì)胞，能不斷進行自我更新并持續(xù)分裂，修復(fù)和更新?lián)p傷的細(xì)胞，而且能根據(jù)內(nèi)部和外界環(huán)境信號來決定植物器官的發(fā)生、生殖生長、衰老等，從而使生長上百年甚

5、至上千年的植物一直保持新生活力。端粒作為染色體末端的簡單重復(fù)序列，在DNA復(fù)制時丟失自己的堿基以保護DNA復(fù)制的完整和穩(wěn)定。當(dāng)端粒長度縮短到一定程度，細(xì)胞就停止分裂，逐漸衰老死亡。因此，端粒對維持染色體的穩(wěn)定和細(xì)胞分裂能力具有重要作用，也成為DNA的“年輪”和分子鐘，在一定程度上反映生物個體的年齡水平。人參皂苷為人參所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對人和動物的干細(xì)胞和端粒長度的調(diào)控有著重要的影響，且動物和植物有相似的干細(xì)胞調(diào)控行為，而植物干細(xì)胞和

6、端粒在植物生長發(fā)育、衰老等生物學(xué)過程中也發(fā)揮著重要作用。因此，基于以上研究基礎(chǔ)，本論文將通過研究人參皂苷對植物干細(xì)胞和端粒的影響，來揭示人參生長發(fā)育中人參皂苷的生理生化功能。通過研究，為初步揭示人參的生長機制提供參考，同時也為藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生理功能研究提供新的研究思路和方法。
　　基于以上研究認(rèn)識，本論文開展了如下工作:
　　1、人參皂苷含量隨年限的變化規(guī)律研究
　　采用UPLC-MS的方法對1～13年人參中的

7、8種主要人參皂苷成分（人參皂苷-Rg1、Re、Rb1、Rb2、 Rc、Rd、Rf、Ro）進行定量分析，發(fā)現(xiàn)人參總皂苷在人參不同藥用部位中的含量差異較為明顯。人參葉中的人參皂苷成分含量最高，其總皂苷含量隨生長年限變化波動較大，在13年內(nèi)總皂苷含量由36.64 mg/g升高到59.03 mg/g，人參皂苷積累增加較為明顯;蘆頭中皂苷含量較葉低，其中2-7年生人參的蘆頭中總皂苷在23.09～31.88 mg/g范圍內(nèi)波動，含量相對穩(wěn)定，而在第

8、8年生時蘆頭中皂苷積累量迅速增加至43.92 mg/g，隨后3年含量基本保持不變(39.56～40.83 mg/g)，當(dāng)生長至第12、13年時，蘆頭中皂苷含量又迅速升高（58.73 mg/g、65.30 mg/g）;人參主根中皂苷含量最低，隨年限增加呈現(xiàn)平穩(wěn)升高的趨勢，在13年內(nèi)人參皂苷積累量增加約1倍(16.27 mg/g～31.14 mg/g)。
　　研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷單體成分在不同部位中的分布也不同，其中人參皂苷Rg1和R

9、e在人參葉中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成分，但在主根和蘆頭中含量卻低于人參皂苷Rb1;齊墩果烷型人參皂苷Ro在3個藥用部位中含量差異不明顯，且均隨年限延長而積累量逐漸增加;人參皂苷在根皮中積累量最多，形成層和韌皮部的人參皂苷含量次之，木質(zhì)部中皂苷的含量是最少，且根皮中人參皂苷含量是其他組織中的2倍以上。
　　2、影響擬南芥根尖干細(xì)胞分裂的人參皂苷成分的篩選研究
　　在細(xì)胞分裂活躍的根尖分生組織的頂端，由一群快速分裂的不同類型的干細(xì)胞

10、圍繞著一團分裂活性極低的細(xì)胞（靜止中心）共同組成根尖干細(xì)胞微環(huán)境的組織結(jié)構(gòu)。由于人參的全基因組序列還未完全被解析，干細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)研究處于空白狀態(tài)，模式植物擬南芥有著相對清晰的干細(xì)胞調(diào)控研究體系。因此，選擇在擬南芥體系中篩選出對植物干細(xì)胞有影響的人參皂苷成分。
　　結(jié)合人參皂菅不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和含量變化規(guī)律，以原人參二醇類成分中含量最多的人參皂苷Rb1及其皂苷元20(S)原人參二醇，原人參三醇類成分中含量最多的人參皂苷Rg1、

11、Re及其皂苷元20(S)原人參三醇和齊墩果烷型人參皂苷Ro等6個代表性成分進行篩選。在含有50、100、150μM人參皂苷成分的1/2 MS培養(yǎng)基中分別播種野生型擬南芥種子（Col-0型），發(fā)現(xiàn)這些成分的加入對擬南芥種子的萌發(fā)沒有影響，但對其幼苗初生根長有不同程度的抑制作用，且具有濃度依賴性，其中以人參皂苷中的某一成分GS1抑制根長作用最為顯著;在組織水平觀察根尖分生區(qū)，發(fā)現(xiàn)分生區(qū)范圍的縮小與抑制根長的趨勢具有一致性;在分子水平上GUS

12、染色觀察分生區(qū)細(xì)胞分裂活性，發(fā)現(xiàn)表征細(xì)胞有絲分裂活性的標(biāo)記基因CycB1;1∶GUS的染色區(qū)域與抑制根長程度也較為一致，其中仍以GS1的作用最為明顯，染色區(qū)域最少。
　　隨后選擇100μM GS1處理熒光標(biāo)記靜止中心(WOX5∶GFP; QC184∶GUS)及根冠干細(xì)胞(J2341∶GFP)區(qū)域的擬南芥材料。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，GS1的加入能促使根尖靜止中心WOX5基因表達的熒光區(qū)域擴展，靜止中心報告基因Q

13、C184的GUS染色區(qū)域也部分?jǐn)U增，預(yù)示著靜止中心細(xì)胞發(fā)生了分裂;同時標(biāo)記根冠干細(xì)胞的報告基因J2341的熒光區(qū)域也發(fā)生了擴展，表征根冠干細(xì)胞發(fā)生了分裂。通過對PLT1/2及SCR/SHR兩個主要的干細(xì)胞調(diào)控通路中的關(guān)鍵基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)GS1的加入并不能影響相關(guān)基因的表達，對建立和維持干細(xì)胞微環(huán)境的生長素的濃度梯度也未發(fā)生較大的改變。
　　研究結(jié)果表明，人參皂苷類成分對擬南芥初生根長有不同程度的抑制作用，這種作用是通過抑制根尖分

14、生區(qū)細(xì)胞分裂活性導(dǎo)致分生區(qū)范圍縮小而實現(xiàn)的; GS1能強烈抑制擬南芥初生根長，但同時卻能促使其局部區(qū)域—根尖干細(xì)胞中心發(fā)生活動，靜止中心和根冠干細(xì)胞均發(fā)生了細(xì)胞分裂。因此，GS1不但能對擬南芥初生根長的生長產(chǎn)生影響，同時也能影響根尖干細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)，促使根尖干細(xì)胞和靜止中心同時發(fā)生分裂，調(diào)控根尖干細(xì)胞的活性，但其作用機制還不清楚。因此，為闡明GS1對擬南芥根長的作用機制，需通過正向遺傳學(xué)方法運用遺傳篩選和圖位克隆的手段找到其作用基

15、因。
　　3、GS1對擬南芥根長影響的遺傳篩選及圖位克隆研究
　　在含有100μM GS1的1/2 MS培養(yǎng)基上播種EMS誘變的約980個編號的擬南芥突變體群，從中篩選出對GS1不敏感的突變體即根長較長的種子，并移于土中收種再進行驗證。在初次篩出的12個突變體材料中最終經(jīng)過第二代種子驗證確定編號為14的突變體(Ginsenoside insensitive mutant: gsi)的初生根長不受GS1的影響，為所需要的陽性材

16、料。不斷播種gsi進行篩選至純合的種子，將純合的植株與另一生態(tài)型（Ler型）植株進行雜交，以突變體F2代雜交種為樣本進行圖位克隆，提取約100個突變體樣品的DNA，以擬南芥5條染色體上22個SSLP標(biāo)記分子進行篩選粗定位，初步確定突變點范圍。在突變位置附近左右分別用1對引物進行篩選，并不斷向內(nèi)側(cè)設(shè)計引物縮小突變位點的范圍以精細(xì)定位，在經(jīng)過約2400個樣品的篩選后，確定突變基因在約60 kb的范圍內(nèi)，在此范圍內(nèi)共包含有10個基因。為確定突

17、變位點，將10個基因全部克隆出來，連接載體測序。測序結(jié)果顯示，序列號為AT5G20950的基因在其CDS區(qū)發(fā)生了一個堿基的突變，核苷酸序列由G突變成了A，同時導(dǎo)致了其氨基酸的變化，由甘氨酸(G)變成了精氨酸(R)，而其他基因核苷酸序列并未發(fā)生改變。通過與SALK突變體庫該基因的突變體(SALK_058396C)表型相比較，發(fā)現(xiàn)SALK_058396C的初生根長也不受GS1的影響，且根長與所篩到的突變體較為一致。將該基因完整的CDS序列通

18、過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到突變體gsi中進行遺傳互補，經(jīng)T2代純合體驗證，其表型也得到了恢復(fù)。因此，可確定該基因的突變確能導(dǎo)致對GS1的不敏感，同時也證明該基因在GS1抑制擬南芥的根長中發(fā)揮重要作用。
　　4、GS1作用基因的功能驗證研究
　　進一步對突變基因(AT5G20950)進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的是一種糖苷水解酶(Glycosyl hydrolase)，因此，將該基因命名為GH。糖苷水解酶蛋白是由625個氨基酸

19、構(gòu)成，有Glyco_hydro_3和Glyco_ hydro_3C2個功能保守區(qū)，其中Glyco_hydro_3C在參與催化反應(yīng)及結(jié)合葡萄糖中發(fā)揮重要作用。而所篩選出的突變位點正是在這一重要保守區(qū)內(nèi)，此突變位點的存在可能也是導(dǎo)致其功能缺失的直接原因。為確定該糖苷水解酶是否對GS1有水解作用，將GH基因連入PMAL載體進行蛋白原核表達。以所得到的蛋白為酶液，NaAC緩沖液(pH5.0)為酶促反應(yīng)液，以GS1為底物進行酶促反應(yīng)。將酶促反應(yīng)產(chǎn)

20、物進樣UPLC-Q/TOF-MS分析，發(fā)現(xiàn)加入表達蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物中有一個新的產(chǎn)物生成，且這一產(chǎn)物的分子離子質(zhì)量數(shù)（m/z）與GS1相比，丟失了一個葡萄糖的分子量。將所生成的新產(chǎn)物與另一皂菅成分GS1-1質(zhì)譜信息相比，二者的保留時間及離子峰均相同;同時將gsi播種于含有100μM GS1-1的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)gsi表現(xiàn)為與Col-0相似的短根表型，GS1-1嚴(yán)重抑制gsi的初生根長，可確定GS1水解后的產(chǎn)物為GS1-1。充分的實驗結(jié)果顯示，

21、在擬南芥體系中，當(dāng)加入GS1處理后，植物體內(nèi)的糖苷水解酶能水解該成分中的一個葡萄糖，轉(zhuǎn)化為另外一種人參皂苷GS1-1，從而發(fā)揮抑制初生根長的作用。
　　5、人參皂苷對人參端粒長度的調(diào)控作用研究
　　為進一步研究人參皂苷對人參端粒長度的調(diào)控作用，采用qPCR(real-timeQuantitative Polymerase Chain Reaction)的方法檢測了1-6年生人參相對端粒長度在不同生長時期的變化情況。在主根中，

22、端粒長度在第1年是較長的，但隨后會出現(xiàn)逐漸縮短的趨勢，在第3、4年端粒長度達到最低值，而后又出現(xiàn)逐漸延長趨勢;人參葉中的端粒長度隨年限變化趨勢與主根較為一致。在不同的生長時期，端粒長度變化較大。端粒這種隨年限的變化很有可能與植物自身的生長發(fā)育調(diào)控有關(guān)。中年限（10-14年）和長年限（15-30年）人參的端粒長度檢測顯示，人參的相對端粒長度有隨年限增加而呈緩慢延長的趨勢。為進一步研究同樣隨年限增加的人參皂苷是否對端粒長度有影響，在人參懸浮

23、細(xì)胞體系中分別加入不同濃度（5、50、200μM）的3種主要人參皂苷成分—人參皂苷Rg1、Re、Rb1，測定處理后端粒的變化。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5、50μM濃度下，3種成分均顯示對人參懸浮細(xì)胞端粒延長的作用，但在200μM濃度下卻有著輕微縮短端粒長度的作用，同時檢測端粒酶基因均表達上調(diào)。因此，本部分的研究結(jié)果顯示，人參端粒長度在1-6年有不穩(wěn)定的變化，但隨著年限的增加，端粒長度呈逐漸延長的趨勢。同時，隨年限增加積累增多的人參皂苷成分對自身

24、端粒有一定的延長作用，且這種作用是通過激活端粒酶活性來實現(xiàn)的。
　　化學(xué)防御一直被認(rèn)為是植物次生代謝產(chǎn)物的主要生理功能，而本研究揭示，次生代謝產(chǎn)物人參皂苷能通過調(diào)控植物干細(xì)胞和端粒長度對植物的生長過程產(chǎn)生影響。作為小草本植物，人參能有長達幾十年的生長周期，其次生代謝產(chǎn)物人參皂苷隨年限增長積累增加。端粒作為年齡的生物標(biāo)記，在草本植物人參中發(fā)現(xiàn)，和“長壽”的木本植物相似，其長度會隨生長年限的增加而延長，且人參皂苷有助于端粒的這種延長效

25、應(yīng)。另外，端粒長度被發(fā)現(xiàn)在植物根尖干細(xì)胞區(qū)域是最長的，本論文同時揭示人參皂苷也能對植物干細(xì)胞產(chǎn)生影響。因此，人參皂苷與植物干細(xì)胞、端粒有著密切的聯(lián)系，通過相互的影響與調(diào)控共同維持著人參的持續(xù)生長，在人參的“長壽”中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　本文在研究思路上，以影響植物生命活力的干細(xì)胞和端粒為切入點，為植物次生代謝產(chǎn)物的生理功能研究提供了新的視角;研究方法上，采用分子遺傳學(xué)的手段闡明了人參中次生代謝產(chǎn)物人參皂苷對生長發(fā)育的生理生化