構(gòu)建用于膀胱癌治療的高效、低副作用的重組BCG.pdf

1、在中國，膀胱癌的發(fā)病率占男性泌尿生殖系惡性腫瘤第1位，而術(shù)后膀胱內(nèi)BCG灌注治療已經(jīng)成為非肌層浸潤性膀胱癌最廣泛采用的免疫治療方案之一。BCG灌注治療對(duì)于膀胱癌的復(fù)發(fā)起著重要的作用，但大劑量BCG灌注會(huì)導(dǎo)致的各種并發(fā)癥，如高熱、血尿、肝炎、及各種系統(tǒng)并發(fā)癥等，而且需要多次用藥，這些弊端限制了BCG灌注治療在膀胱癌中的應(yīng)用。因此探尋低毒副作用，且提高腫瘤特異性殺傷能力的BCG，成為膀胱癌治療目前亟待解決的難題。
　　本研究利用合成生

2、物學(xué)的方法進(jìn)行基因克隆以及構(gòu)建重組質(zhì)粒和重組型BCG（rBCG）。通過用PRIMER5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并利用PCR法分別擴(kuò)增膀胱癌腫瘤特異性抗原Survivin、HYAL-1、NY-ESO-1、MAGE3基因片段，以及細(xì)胞因子IFN-γ、GM-CSF、IL-2基因片段。將PCR產(chǎn)物純化后與pUC18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、雙酶切分析、PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定；同時(shí)提取重組質(zhì)粒，雙酶切后亞克隆入pMV306原核表達(dá)載

3、體中。該工作為后續(xù)構(gòu)建rBCG打下了基礎(chǔ)。
　　同時(shí)，為了能夠在BCG（或結(jié)核分枝桿菌）中整合多個(gè)基因，實(shí)驗(yàn)利用恥垢分枝桿菌（Mycobacteria smegmatis）自身重組系統(tǒng)開發(fā)了一套大片段DNA體內(nèi)重組克隆系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)拼接了長約100kb的利福霉素生物合成基因簇。
　　此外，研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)跟滲透壓防御相關(guān)的生物合成基因簇（ectcluster）只分布于生長速度快的分枝桿菌中，在生長速度慢的分枝桿菌（如BCG，結(jié)核分枝

4、桿菌等）中不存在。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)ect cluster在大部分的放線菌中都廣泛存在。為了鑒定該基因簇的生物功能，實(shí)驗(yàn)利用放線菌模式菌株—天藍(lán)色鏈霉菌，從體內(nèi)、體外兩個(gè)方面，證明了該基因簇與菌體的滲透壓防御有直接關(guān)系，并且其表達(dá)與菌體的氮代謝直接相關(guān)。目前還不清楚ectcluster是否對(duì)BCG生長速率以及致病性有影響，其實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)一步進(jìn)行之中。
　　綜上所述，本研究對(duì)rBCG的構(gòu)建體系及構(gòu)建流程進(jìn)行了測(cè)試，開發(fā)了一套分枝桿菌體內(nèi)