雞大腸桿菌1型菌毛呈現(xiàn)載體構(gòu)建及部分功能基因與菌毛表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、大腸桿菌 1 型菌毛是最常見的大腸桿菌附屬物，是一種毛發(fā)樣蛋白突起，直徑5-7nm，長(zhǎng)1-2μm，由一個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)的多肽(菌毛素)纏繞而成的螺旋中空結(jié)構(gòu)。曾經(jīng)一度認(rèn)為 1 型菌毛完全是由菌毛素構(gòu)成，但目前的研究表明，至少還有三種亞單位參與了菌毛的構(gòu)成。其中一個(gè)亞單位(位于頂端的黏附素)賦予了 1 型菌毛陽(yáng)性大腸桿菌凝集各種紅細(xì)胞的能力。這種凝集能夠被甘露糖，α-甘露多糖以及某些甘露糖類似物所抑制，表明紅細(xì)胞上具有甘露糖或甘露糖類似物受體。

2、 1 型菌毛由染色體編碼，包含多個(gè)基因簇。除了編碼菌毛結(jié)構(gòu)蛋白的基因(fimA、fimF、fimG和fimH)外；基因fimB和fimE編碼調(diào)控蛋白，調(diào)節(jié)fimA基因的表達(dá)，相當(dāng)于一個(gè)控制菌毛表達(dá)的開關(guān)；另外兩個(gè)基因fimC和fimD被認(rèn)為是菌毛跨膜和裝配所必需的。 禽源性大腸桿菌與人源性大腸桿菌在基因序列上存在很高的同源性，根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的人源性大腸桿菌 1 型菌毛操縱子基因序列，用DNAStar和Primer 5.

3、0軟件分析設(shè)計(jì)了九條引物，利用PCR技術(shù)以 1 型菌毛陽(yáng)性株YR10(018)基因組為模板，分段擴(kuò)增fim基因片段BEA、IC、D、D’和FGH，采用酶切、連接、T/A克隆等分子生物學(xué)方法將BEA、IC、D分別克隆到pUCl8或pUCm-T載體中，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pBEA、pUCm-IC和pUCm-D，其中pBEA包含fimB、fimE和fimA基因，pUCm-IC包含fimI和fimC基因，pUCm-D含有fimD基因。然后利用這些克隆

4、質(zhì)粒，用相應(yīng)的限制內(nèi)切酶及T4 DNA Ligase將各段連接起來(lái)，構(gòu)建質(zhì)粒pBC和pBD，其中pBC含有基因fimB、fimE、fimA、fimI和fimC，pBD是將片段D連到pBC上，即比pBC多了fimD基因，最后采用SOE PCR方法將D’和FGH連接起來(lái)，克隆到pBC上，構(gòu)建成包含整個(gè)1型菌毛操縱子基因的質(zhì)粒pBH。 將pBC、pBD和pBH分別轉(zhuǎn)化HB101(fim<'->)，經(jīng)過(guò)血凝試驗(yàn)、甘露糖敏感性血凝試驗(yàn)、抗

5、體凝集試驗(yàn)、酵母菌吸附試驗(yàn)及電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，重組菌HB101(pBC)不與抗菌毛血清反應(yīng)，也不表達(dá)菌毛；重組菌HB101(pBD)和HB101(pBH)均可以與抗菌毛血清反應(yīng)，電鏡下能夠明顯看到菌毛，但HB101(pBD)不具有血凝特性，也不能與吸附酵母菌；而HB101(pBH)有明顯的血凝特性和吸附酵母的能力，且能夠被甘露糖所抑制。 本試驗(yàn)將各重組菌及野生菌之間相互進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌HB101(pBH)所表達(dá)的菌毛血凝性

6、更強(qiáng)，與抗菌毛血清的凝集反應(yīng)更明顯，吸附酵母的能力更強(qiáng)；而重組菌HB101(pBD)由于缺失了基因fimF，fimG和fimH，因此不具有血凝性，也不能吸附酵母菌，與抗菌毛血清的反應(yīng)也沒(méi)有野生菌毛明顯，可見，fimF、fimG和fimH雖不是菌毛表達(dá)所必需的，但對(duì)菌毛的生物學(xué)特性有著重要的影響；而重組菌HB101(pBC)與HB101(pBD)相比由于缺失了基因fimD，無(wú)法表達(dá)菌毛，由此可見基因fimD是1型菌毛表達(dá)所必需的。