BMSc復(fù)合DBM修復(fù)骨缺損及補(bǔ)腎益骨湯輔助治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：長(zhǎng)期以來(lái)，在生物材料及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，骨缺損修復(fù)一直是一個(gè)重要的研究課題，人們嘗試過(guò)很多治療方法，但均存在一定的問(wèn)題和缺陷。本課題采用組織工程學(xué)的方法構(gòu)建復(fù)合人工骨，并在傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合的方法來(lái)尋求一個(gè)合理解決骨缺損的一種方法。對(duì)以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：(1)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSc)進(jìn)行體外分離培養(yǎng)及擴(kuò)增，觀察其原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)及生物學(xué)特點(diǎn)。(2)觀察補(bǔ)腎益骨湯對(duì)體外培養(yǎng)的兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSc)的影

2、響。(3)構(gòu)建BMSc復(fù)合DBM(同種異體脫鈣骨)的復(fù)合人工骨，觀察其在骨缺損修復(fù)中的效果。(4)術(shù)后采用中藥灌飼的方法，觀察補(bǔ)腎益骨湯對(duì)復(fù)合人工骨在成骨作用方面的影響。 方法：(1)于無(wú)菌條件下雙側(cè)髂后上棘髂骨穿刺抽取大白兔骨髓，用密度梯度分離純化BMSc，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代，用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代細(xì)胞，逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。對(duì)傳代細(xì)胞進(jìn)行HE染色觀察。對(duì)傳代細(xì)胞采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液及條件培養(yǎng)液培養(yǎng)10天后的培養(yǎng)液做堿性

3、磷酸酶定量測(cè)定，將DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含15％新生小牛血清)做為空白組對(duì)比。(2)將傳代細(xì)胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，以細(xì)胞濃度為1.5×104每孔接種于24孔培養(yǎng)板，將補(bǔ)腎益骨湯按濃度分別為10、100、1000μg/ml加入15％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于1、3、5、7天吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，每孔加0.1mlPBS和10μ1MTT(5mg/m1)，37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4～6h。加入二甲基亞砜1ml,振蕩15mi

4、n使細(xì)胞裂解，置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定光密度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為630nm。測(cè)定補(bǔ)腎益骨湯對(duì)BMSc增殖影響情況，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液組。(3)取健康大白兔四肢長(zhǎng)骨骨端及椎體、髂骨，剔除骨膜、軟骨、皮質(zhì)骨及軟組織，以溫鹽水反復(fù)沖洗清除骨髓、血污及表面油脂。將其松質(zhì)骨部分制成0.3cm×0.3cm×0.4cm顆粒，余制成1.5cm×0.3cm×0.4cm條塊狀。1∶1氯仿/甲醇脫脂12h，0.6mol/L醫(yī)用鹽酸部分脫鈣2h，蒸餾水持續(xù)沖洗至pH=

5、7.0，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒，細(xì)菌培養(yǎng)3次無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，密封后置冰箱(4℃)內(nèi)備用。將BMSc收集離心(1500r/min，10min)，取其沉淀，制成0.5ml細(xì)胞懸液。每只大白兔可獲得細(xì)胞數(shù)共5×106個(gè)。將上述細(xì)胞懸液接種于已制備好的異體松質(zhì)骨基質(zhì)上制備成復(fù)合人工骨。將大白兔隨機(jī)分為4組，每組12只。一組為DBM組，一組為復(fù)合人工骨組，一組為復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌飼組，一組為假手術(shù)組(切取部分橈骨后，不移植材料)。建立大白兔骨缺損的

6、模型，切開顯露兔橈骨，切除部分橈骨，造成長(zhǎng)1.5cm節(jié)段性骨缺損，用生理鹽水反復(fù)沖洗術(shù)區(qū)，按分組植入各組材料或者留作空白，不作內(nèi)外固定，分層縫合創(chuàng)口。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，不制動(dòng)。術(shù)后選取1、2、3月進(jìn)行①大體觀察：觀察術(shù)后兔的飲食、活動(dòng)、傷口反應(yīng)；取材后植入材料的表面情況、成骨和炎癥反應(yīng)等。②X線觀察：用掃描儀將X線圖象輸入計(jì)算機(jī)，選取骨缺損局部2.0cm×1.0cm進(jìn)行圖像分析，觀察骨痂密度。③堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：于術(shù)后1、2

7、、3個(gè)月檢測(cè)血清堿性磷酸酶含量。④組織學(xué)觀察：在距植入各組人工骨兩端約0.5cm的正常橈骨處切斷取材，脫鈣制成切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。(4)復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌飼組給予補(bǔ)腎益骨湯胃管注入，劑量為6g/kg，其它組喂飼等體積生理鹽水，以上用藥每天1次，全程給藥，在同一條件下喂養(yǎng)，并與1、2、3月觀察各指標(biāo)。 結(jié)果：(1)成年大白兔BMSc體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，原代細(xì)胞12～14d細(xì)胞長(zhǎng)成單層，傳代后8～10d細(xì)胞即可鋪滿瓶底

8、，HE染色見BMSc分裂相多見，細(xì)胞呈梭形、多角形。ALP含量測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活性為(20.5±1.29)U/ml,條件培養(yǎng)液為(29.75±4.85)U/ml,空白對(duì)照為(6.50±1.29)U/ml,標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液與條件培養(yǎng)液均與空白對(duì)照差異顯著(P＜0.01)，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液與條件培養(yǎng)液間配對(duì)t檢驗(yàn)示P＜0.05,差異顯著。(2)MTT法檢測(cè)補(bǔ)腎益骨湯對(duì)BMSc增殖的影響，結(jié)果表明中藥組與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組有顯著性差異，其中高濃度組對(duì)

9、細(xì)胞的增殖有抑制作用，低、中濃度組對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，中濃度組對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖最為明顯。(3)復(fù)合人工骨組與DBM組對(duì)比觀察：①大體觀察：4周時(shí)復(fù)合人工骨組橈骨缺損區(qū)已飽滿，質(zhì)尚軟；8周時(shí)明顯飽滿，質(zhì)硬，已有部分骨髓腔再通；12周骨髓腔均再通，與鄰近正常骨色澤無(wú)差異，而DBM組至12周僅有部分骨髓腔再通；②將X線圖像置于計(jì)算機(jī)后，測(cè)得骨缺損區(qū)骨痂灰度值于4、8、12周骨缺損區(qū)骨痂灰度值復(fù)合人工骨組均大于DBM組，其差異有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；③堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：測(cè)定各時(shí)期的血清ALP含量，復(fù)合人工骨組＞DBM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；④組織形態(tài)學(xué)觀察：復(fù)合人工骨組4周可見植入物開始降解吸收，在其局部吸收區(qū)出現(xiàn)軟骨細(xì)胞，外周以成骨細(xì)胞為主，并見類骨及新生骨組織和散在局灶編織骨小梁網(wǎng)形成。未見明顯炎性細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；8周植入物繼續(xù)吸收，大量成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和新骨組織形成，新生毛細(xì)血管豐富，骨髓腔已形成；12周植入物基本已吸

11、收，斷端由板層骨連接，大部分骨細(xì)胞已成熟，可見有細(xì)胞，骨髓腔再通。DBM組4周纖維組織從斷段間隙呈梭性伸入，出現(xiàn)較多間充質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，有少許軟骨細(xì)胞，未見明顯新骨形成；8周見軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，新骨出現(xiàn)，編織骨已向板層骨過(guò)渡，成骨活躍，但排列欠規(guī)則；12周骨髓腔大部分再通，板層骨排列規(guī)則，與復(fù)合人工骨組8周一致。(4)復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌飼組與復(fù)合人工骨組對(duì)比觀察：①大體觀察：傷口無(wú)紅腫、滲液等反應(yīng)，傷口均一期愈合；②X線觀察

12、4、8周骨缺損區(qū)骨痂灰度值復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌飼組＞復(fù)合人工骨組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，12周骨缺損區(qū)骨痂灰度值無(wú)顯著性差異；③堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：4周血清ALP含量，復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌飼組＞復(fù)合人工骨組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；8周血清ALP含量，復(fù)合人工骨組＞復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌飼組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；12周血清ALP含量無(wú)顯著性差異；④組織形態(tài)學(xué)觀察：術(shù)后第4周復(fù)合人工骨術(shù)后中藥灌

13、飼組骨折斷端間有大量的新生編織骨、少量軟骨細(xì)胞，并見豐富的新生血管，不規(guī)則骨髓腔形成；復(fù)合人工骨組可見纖維細(xì)胞，少量新生編織骨生長(zhǎng)，新生血管較少。術(shù)后第8周中藥組已基本骨性愈合，骨髓腔溝通；復(fù)合人工骨組斷端間由新生編織骨連接，出現(xiàn)不規(guī)則的骨髓腔；12周兩組植入物基本已吸收，斷端由板層骨連接，大部分骨細(xì)胞已成熟，可見有骨髓腔再通。 結(jié)論：(1)大白兔BMSc的體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)，可誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，可作為骨組織工程的種子細(xì)胞；(2)