白樺BplMYB46基因調(diào)控抗旱耐鹽和次生壁形成的分子機(jī)理.pdf

1、MYB(avian myeloblastosis)轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，主要參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應(yīng)答。本研究在白樺的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)一個(gè)MYB基因BplMYB46，屬于R2R3 MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)BplMYB46可能與植物逆境脅迫及次生壁的形成相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了BplMYB46基因在響應(yīng)非生物脅迫及次生細(xì)胞壁發(fā)育過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)制，為白樺逆境脅迫應(yīng)答及次生代謝調(diào)控方面的

2、研究提供理論基礎(chǔ)。
　　1、構(gòu)建35s-BplMYB46-GFP載體，利用基因槍技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示BplMYB46基因定位在細(xì)胞核中。BplMYB46基因在NaCl、ABA和Mannitol脅迫處理6-24 h時(shí)呈上調(diào)表達(dá)，結(jié)果顯示BplMYB46基因能夠被逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。BplMYB46基因在莖中的表達(dá)量最高，根中其次，葉中最低，并且在莖頂端、中部和基部的表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)。
　　2、構(gòu)建BplM

3、YB46基因過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入白樺，獲得BplMYB46基因過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的白樺轉(zhuǎn)基因植株。在NaCl、ABA和Mannitol脅迫下，以野生型白樺為對(duì)照，BplMYB46基因過(guò)表達(dá)株系的鮮重、根長(zhǎng)以及葉綠素含量較高，相對(duì)電導(dǎo)率和失水率較低，并且BplMYB46基因能夠通過(guò)調(diào)控SOD和POD以及P5CS、P5CDH和ProDH等基因的表達(dá)來(lái)提高SOD和POD的活性以及脯氨酸的含量，從而降低ROS在逆境下的積累，進(jìn)而顯著增強(qiáng)

4、轉(zhuǎn)基因白樺的抗逆能力。
　　3、將兩個(gè)月苗齡的BplMYB46基因過(guò)表達(dá)、抑制表達(dá)和野生型白樺的莖基部分別橫切，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、鹽酸間苯三酚和熒光增白劑染色，結(jié)果顯示與野生型白樺相比，BplMYB46基因過(guò)表達(dá)白樺株系的次生壁發(fā)育程度較高，抑制表達(dá)的次生壁發(fā)育程度較低。以一年生野生型和轉(zhuǎn)基因白樺莖為材料進(jìn)行次生壁組分含量的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BplMYB46基因過(guò)表達(dá)白樺的木質(zhì)素和半纖維素含量比野生型高，纖維素含量比野生型低;抑制表達(dá)白樺

5、的木質(zhì)素和半纖維素含量比野生型低，纖維素含量比野生型高。以野生型白樺為對(duì)照，與木質(zhì)素、纖維素合成相關(guān)的酶PAL、CCo、4CL、POD、LAC、Cesa和3個(gè)可能與次生壁合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子在BplMYB46過(guò)表達(dá)白樺中上調(diào)表達(dá)，在BplMYB46抑制表達(dá)白樺中下調(diào)表達(dá)，由此證明BplMYB46基因能夠通過(guò)調(diào)控木質(zhì)素、纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)白樺次生壁的形成。
　　4、利用酵母雙雜交技術(shù)證明BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)

6、錄激活活性，其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在C端第697-915bp內(nèi);BplMYB46轉(zhuǎn)錄因子能夠與自身形成同源二聚體并與白樺的5個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體。
　　5、利用酵母單雜交技術(shù)確定BplMYB46基因能識(shí)別8個(gè)順式作用元件，分別為E-box、LTRECORE、GT-1、M1、M2、M3、TCbox和AGbox，其中E-box元件主要參與光響應(yīng)和苯丙氨酸生物合成途徑，LTRECORE是一個(gè)低溫調(diào)控元件，GT-1元件能夠增強(qiáng)植物抗病和耐

7、鹽能力，M1為響應(yīng)低溫和干旱脅迫的MBSI型元件，M2是擬南芥AtMYB46識(shí)別的與次生細(xì)胞壁形成相關(guān)的元件，M3為擬南芥MYB識(shí)別的抗干旱的順式作用元件，TCbox和AGbox為兩個(gè)未知功能的元件，可能是BplMYB46基因調(diào)控的新元件。CHIP-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)BplMYB46能夠與靶基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件結(jié)合從而調(diào)控它們的表達(dá)，這些靶基因與植物逆境脅迫和次生細(xì)胞壁的形成相關(guān)。
　　6、對(duì)BplMYB46基因過(guò)表達(dá)和

8、抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2421條差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?52條，下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?469條;差異基因涉及新陳代謝、次生代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及苯丙烷和類(lèi)黃酮生物合成等途徑。在差異基因中發(fā)現(xiàn)一些與植物逆境脅迫相關(guān)的ERF基因、超氧化物歧化酶(SOD)基因、過(guò)氧化物酶(POD)基因、熱激蛋白（HSP）基因，與木質(zhì)素合成相關(guān)的肉桂醇脫氫酶(CAD)基因、肉桂酰CoA還原酶（CCR）基因和漆酶