低氧誘導因子-1a在心肌缺血預處理與后處理心肌保護中的作用.pdf

1、本文研究目的： 1．觀察在心肌缺血/再灌注時給予缺血預處理及后處理后低氧誘導因子-1α的蛋白表達情況： 2．探討低氧誘導因子-1α的表達變化與缺血預處理及后處理的心肌保護效應的關系。 研究方法： 選取健康雄性Wistar大鼠40只，隨機分為4組： ①偽手術組(sham，n=10)．僅在左冠狀動脈前降支(left anterior descending artery，LAD)下穿線，不結扎，持續(xù)22

2、5min； ②缺血/再灌注組(I/R，n=10)：可逆性結扎LAD造成心肌缺血45min，再灌注3h： ③缺血預處理組(IP，n=10)：給予3個循環(huán)的5 min缺血/5 min再灌注作為缺血預處理，隨后給予可逆性結扎LAD造成心肌缺血45min，再灌注3h； ④缺氧后處理組(PC，n=10)：可逆性結扎LAD造成心肌缺血45min，隨即進行3個循環(huán)的再灌注10s/缺血10s的缺血后適應，再行再灌注3h。

3、 實驗結束后用Even's blue和TTC雙染，測定心肌危險區(qū)與梗塞區(qū)面積：利用免疫組織化學技術、Western蛋白免疫印跡檢測心肌HIF-1α的表達；用DNA原位末端缺口標記法并配合caspase-3的活性檢測對心肌細胞凋亡進行檢測；制備血清，檢測CK活性和MDA含量。 研究結果： 1.缺血/再灌注模型的建立。 1.1心肌缺血/再灌注損傷對心肌梗塞面積的影響危險區(qū)面積占左心室面積的百分比(AAR/LV比值)：

4、在偽手術組與缺血/再灌注組之間無顯著性差異，各組動物模型的缺血程度大體一致，具有可比性。 心肌梗塞面積占危險區(qū)面積百分比(AN/AAR比值)：缺血/再灌注(I/R)組與偽手術(sham)組相比明顯增高(44.17％±3.24％vs.3.36％±0.87％，P<0.01)(表1，圖2，圖3)。 1.2心肌缺血/再灌注損傷對血清肌酸激酶(CK)活性的影響實驗采用CK活性作為評價心肌損傷的指標。經CK試劑盒檢測可見，缺血/再灌

5、注(I/R)組與sham組相比，血清CK活性明顯增高(10.17±2.36 U/ml vs.0.037±0.01U/ml，P<0.01)，(表1，圖4)。 1.3心肌缺血/再灌注損傷對血清丙二醛(MDA)含量的影響MDA含量可反應機體內脂質過氧化的程度，同時間接地反應出細胞損傷的程度。結果顯示：缺血/再灌注(I/R)組血清MDA含量明顯高于sham組(0.27±0.03 nmol/ml vs.0.04±0.01 nmol/ml，

6、P<0.01)(表1，圖5)。 1.4.心肌缺血/再灌注損傷對細胞凋亡的影響DNA原位末端缺口標記法(TUNEL)心肌細胞凋亡檢測結果顯示：偽手術組(sham)大鼠心肌組織細胞凋亡指數為(1.45±0.41)％，缺血/再灌注組(I/R)心肌細胞凋亡指數明顯增高達到(17.68±2.44)％，I/R與sham兩組相比有統計學差異(P<0.01)(圖6，圖7)。 由于TUNEL法檢測細胞凋亡具有敏感性高、但特異性較差的特點，

7、因此我們配合檢測了缺血/再灌注心肌組織的caspase-3比活性來共同說明心肌細胞的凋亡情況。caspase-3檢測結果顯示：與sham組(1.00±0.14)相比，缺血/再灌注組caspase-3比活性明顯增高，達到2.22±0.39(P<0.01)(圖8)。 以上結果均證明心肌缺血/再灌注模型建立成功。 2.缺血預處理和缺血后處理對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用。 2.1缺血預處理和缺血后處理對心肌梗塞面積的

8、影響危險區(qū)面積占左心室面積的百分比(AAR/LV比值)：在缺血/再灌注組、缺血預處理組和缺血后處理之間無顯著性差異，各組動物模型的缺血程度大體一致，具有可比性(見表2，圖2，圖9a)。 心肌梗塞面積占危險區(qū)面積百分比(AN/AAR比值)：缺血預處理組(IP)的AN/AAR比值為(23.76±7.78)％，與缺血/再灌注組(44.17％±3.24％)相比明顯降低(P<0.01)；缺血后處理(PC)的AN/AAR比值為(19.79±

9、2.42)％，與I/R組相比也明顯降低(P<0.01)；而IP與PC相比，則無統計學差異(表2，圖2，圖9b)。 2.2缺血預處理和缺血后處理對血清肌酸激酶(CK)活性的影響缺血/再灌注組(I/R)血清肌酸激酶活性為10.17±2.36U/ml，缺血預處理組(IP)血清肌酸激酶活性為7.84±0.87U/ml，與IfR組相比明顯降低(P<0.05)：缺血后處理(PC)組血清肌酸激酶活性(7.67±1.15U/ml)與I/R組相比

10、也明顯降低(P<0.05)；而IP組與PC組相比，則無統計學差異(表3，圖10)。 2.3缺血預處理和缺血后處理對血清丙二醛(MDA)含量的影響血清MDA含量在缺血預處理組(IP)組為0.16±0.02 nmol/ml，缺血后處理組(PC)為0.16±0.02 nmol/ml。IP、PC組與缺血/再灌注組(0.27±0.03 nmol/ml)相比，均顯著降低(P<0.01)；而IP組與PC組相比無統計學差異。(表3，圖11)。

11、 2.4缺血預處理和缺血后處理對細胞凋亡的影響DNA原位末端缺口標記法(TUNEL)心肌細胞凋亡檢測：缺血/再灌注組(I/R)心肌細胞凋亡指數為(17.68±2.44)％，預處理組(IP)及后處理組(PC)與UR組相比心肌細胞的凋亡均顯著減少，其細胞凋亡指數分別降至(13.79±1.29)％和(11.34±1.54)％，P值均小于0.01(表4，圖12，圖13a)。IP組與PC組相比，未見統計學差異。 caspase-3比

12、活性分析：caspase-3比活性在IP組為1.53±0.25，PC組為1.23±0.26，與I/R組(2.22±0.39)相比均顯著降低(P<0.01)(表4，圖13b)。IP組與PC組相比無統計學差異。檢測結果提示，預處理及后處理均可抑制缺血/再灌注后心肌細胞的凋亡。其檢測結果與TUNEL法基本一致。 3.心肌組織HIF-1α蛋白表達量檢測。 3.1心肌組織HIF-1α蛋白表達量的免疫組織化學檢測偽手術(sham)組

13、大鼠心肌組織僅有少量HIF-1α蛋白表達，缺血/再灌注組(I/R)與sham組相比，其HIF-1α免疫組化染色積分光密度(IOD)顯著增強(8331.64±527.40vs.2263.54±523.32，P<0.01)。缺血預處理組(IP)和缺血后處理組(PC)與I/R組相比，它們的HIF-1α IOD均值明顯增強，分別為9394.61±757.31和9847.20±940.66，均有統計學意義(P<0.05和P<0.01)(圖14，圖

14、15)。免疫組化染色結果可見HIF-1α在細胞核與細胞漿內均有表達。 3.2心肌組織HIF-1α蛋白表達量Western-blot測定缺血/再灌注組(I/R)與sham組相比能明顯誘導HIF-1 α蛋白的表達(1.70±0.34 vs.1.0±0.20，P<0.01)，而缺血預處理(TP)和缺血后處理(PC)均可顯著增加I/R后心肌細胞的HIF-1α蛋白表達量，分別為(2.13±0.39)和(2.07±0.33)，P值均小于0.

15、05(圖16，圖17)。 4.HIF-1α蛋白表達量與反映心肌損傷各指標(心肌梗塞面積、CK活性、MDA含量及caspase-3比活性)之間的相關性分析采用SPSS 11.0軟件對各組心肌梗塞面積、CK活性、MDA含量及caspase-3比活性分別與HIF-1α表達量進行相關分析，結果表明：心肌梗塞面積與HIF-1α蛋白表達量呈負相關，其相關系數為r=-0.842，P<0.01(見圖18)；CK活性與HIF-1α蛋白表達量呈負相

16、關，r=-0.796，P<0.01(見圖19)；MDA含量與HIF-1α蛋白表達量呈負相關，r=-0.839(見圖20)：caspase-3比活性與。HIF-1 α蛋白表達量也呈負相關，r=-0.84，P<0.01(見圖21)。 研究結論： (1).缺血預處理和后處理對心肌缺血/再灌注損傷均具有保護作用，能明顯降低心梗面積、CK活性和MDA含量，并減少心肌細胞的凋亡。 (2).大鼠心肌在缺血/再灌注后，HIF-1

17、α的蛋白表達量明顯增加，提示該因子是心肌細胞缺血時的重要分子反應。 (3).心肌缺血預處理和后處理能使心肌缺血/再灌注后的HIF-1α蛋白表達量進一步明顯增加，提示缺血預處理和后處理均有誘導心肌組織HIF-1α表達的效應。 (4).缺血預處理及后處理所引起的HIF-1α蛋白表達量的增加與反映心肌損傷各指標之間均有很高的負相關性，提示HIF-1α與缺血預處理以及后處理的心肌保護作用有密切關系。 (5)．缺血預處理與