巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致聽力損失的發(fā)病機(jī)制及宮內(nèi)基因治療的初步探索.pdf

1、第一部分MCMV 感染導(dǎo)致聽力損失的發(fā)病機(jī)制研究
　　 目的：建立小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)感染導(dǎo)致聽力損失的小鼠動(dòng)物模型，研究高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)細(xì)胞信號通路在其發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：體外細(xì)胞培養(yǎng)法制備MCMV Smith株，細(xì)胞病變法(CPE)測定病毒致半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。ELISA法篩選MCMV IgM、IgG均陰性的BALB/c小鼠，雌雄小鼠交配受孕，待分娩后隨機(jī)選擇乳鼠分為病

2、毒感染組和實(shí)驗(yàn)對照組，于生后24h內(nèi)顱內(nèi)注射病毒懸液100TCID50/10μL和等量無菌生理鹽水。觀察各組幼鼠的生存發(fā)育情況；測定2周齡幼鼠的聽性腦干反應(yīng)(ABR)；取幼鼠內(nèi)耳組織分別采用RT-PCR和Western Blot法檢測MCMV和HMGB-1 mRNA、糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和NF-κB抑制物(IκBα)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：MCMV TCID50為105.22/0.1mL。病毒感染組幼鼠存活44/121

3、只，存在明顯生長發(fā)育異常；實(shí)驗(yàn)對照組幼鼠存活47/47只，無顯著異常。ABR測定聽閾顯示病毒感染組為28.42±3.03 dB，實(shí)驗(yàn)對照組為15.66±0.38 dB，差異有非常顯著意義(P<0.01)。
　　 病毒感染組MCMV mRNA檢測陽性，實(shí)驗(yàn)對照組陰性；HMGB-1 mRNA病毒感染組顯著高于實(shí)驗(yàn)對照組(P<0.05)；病毒感染組RAGE蛋白表達(dá)較實(shí)驗(yàn)對照組明顯升高，而IκBα明顯降低，差異均有非常顯著意義(P<0.

4、01)。
　　 結(jié)論：成功建立了MCMV感染導(dǎo)致聽力損失的動(dòng)物模型；HMGB-1/RAGE/NF-κB通路可能在CMV感染導(dǎo)致的聽力障礙發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位。
　　 第二部分pshHMGB-1-EGFP 雙基因載體的構(gòu)建和體外表達(dá)
　　 目的：構(gòu)建HMGB-1短發(fā)夾狀RNA(shRNA)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的雙基因真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，以篩選出最有效的干擾質(zhì)粒用于宮內(nèi)基因治療(IU

5、GT)活體實(shí)驗(yàn)。
　　 方法：設(shè)計(jì)并合成5種DNA寡核苷酸雙鏈，分別含有被9bp莖環(huán)(loop)序列間隔的4個(gè)HMGB-1基因片段的反向重復(fù)序列以及陰性對照序列NC，與攜帶EGFP基因的pGenesil-1質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pshHMGB-1-EGFP a、b、c、d和陰性對照質(zhì)粒pNC-EGFP。對重組質(zhì)粒酶切鑒定和測序后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR和We

6、stern Blot測定HMGB-1mRNA和蛋白水平。
　　 結(jié)果：Sal I酶切鑒定和測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；在熒光顯微鏡下可以觀察到NIH/3T3細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染率達(dá)57.25％；分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pshHMGB-1-EGFP a、b、d的3組細(xì)胞HMGB-1 mRNA水平均呈不同程度下降，以質(zhì)粒d最為明顯，與其余各組差異具有顯著意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pshHMGB-1-EGFP a、

7、b、d的3組細(xì)胞HMGB-1蛋白水平均降低，以d最為明顯，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒NC組和空白細(xì)胞組的差異具有非常顯著意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pshHMGB-1-EGFP雙基因真核表達(dá)載體；重組干擾質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，并產(chǎn)生RNAi效應(yīng)抑制HMGB-1表達(dá)，為RNAi用于IUGT的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分pshHMGB-1-EGFP用于宮內(nèi)基因治療的初步研究
　　 目的：

8、觀察pshHMGB-1-EGFP重組質(zhì)粒通過胎盤轉(zhuǎn)染胎兒的效率和胎兒體內(nèi)的RNAi效應(yīng)，探索RNAi聯(lián)合IUGT治療先天性疾病的可能性。
　　 方法：將孕12.5d BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：pshHMGB-1-EGFP＋脂質(zhì)體組(1組)，pNC-EGFP＋脂質(zhì)體組(2組)，pNC-EGFP組(3組)，生理鹽水組(4組)。分別經(jīng)尾靜脈注射DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物(或質(zhì)粒DNA或無菌生理鹽水)。72h后處死孕鼠，分離胎盤和胎鼠各臟

9、器，熒光顯微鏡檢測胎盤和胎鼠體內(nèi)EGFP表達(dá)；RT-PCR檢測胎鼠HMGB-1 mRNA水平；電泳遷移率改變分析(EMSA)測定胎鼠NF-κB活性。
　　 結(jié)果：借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的1、2組孕鼠所有胎仔體內(nèi)均可見綠色熒光，單純質(zhì)粒注射的3組孕鼠所產(chǎn)41只胎仔均未檢出熒光。1、2組胎盤絨毛膜板和迷路區(qū)、胚胎肝、腎、腦組織局部尤其腦室、心肌纖維之間小血管、大血管壁、肺間質(zhì)血管壁、脾皮質(zhì)及髓質(zhì)血竇均可見較強(qiáng)烈綠色熒光表達(dá)，3、4組相應(yīng)區(qū)域