應(yīng)用大塊平鋪法對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、傳代、凍存及復(fù)蘇的研究.pdf

1、目的:應(yīng)用四種不同的培養(yǎng)方法進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、傳代、凍存、復(fù)蘇，比較各方法之間優(yōu)劣，探索并建立一種簡(jiǎn)單、實(shí)用的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為再生醫(yī)學(xué)以及實(shí)驗(yàn)研究提供新的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
　　 方法:分別以1大塊平鋪法;2傳統(tǒng)組織塊法;3膠原酶Ⅳ消化法;4.膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法，四種不同的方法對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄各組細(xì)胞首次融合時(shí)間、各組

2、成功率，并以臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活性，以第3代細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞免疫表型。
　　 結(jié)果:1細(xì)胞形態(tài):鏡下可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，無(wú)序生長(zhǎng)，可呈渦旋狀生長(zhǎng)。2免疫表型鑒定:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行免疫表型鑒定。結(jié)果顯示:CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽(yáng)性表達(dá)，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達(dá)。3統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析（由于膠原酶Ⅳ消化法無(wú)一

3、例成功，則不做分析）。3.1首次融合時(shí)間:大塊平鋪法(17.81±0.85d)明顯早于傳統(tǒng)組織塊法(24.89±0.97d)，差異有顯著性(p＜0.05)，但明顯晚于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(7.35±0.61d)，差異有顯著性(p＜0.05)。3.2穩(wěn)定傳代:大塊平鋪法(11.08±0.74代)與傳統(tǒng)組織塊法(11.04±0.77代)無(wú)明顯差別，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)，但明顯長(zhǎng)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(6.82±0.6

4、4代)，差異有顯著性(p＜0.05)。3.3細(xì)胞活性:大塊平鋪法(90.84±0.83％)與傳統(tǒng)組織塊法(90.67±0.88％)無(wú)明顯差別，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05），但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(75.06±0.90％)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。3.4成功率:大塊平鋪法與傳統(tǒng)組織塊法差異無(wú)顯著性(p＞0.0167)，但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法，差異有顯著性(p＜0.0167)。
　　 結(jié)論:

5、1臍帶華通膠組織是人間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來(lái)源。2應(yīng)用大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法三種方法可成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，而應(yīng)用膠原酶Ⅳ消化法則很難成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，原因在于華通膠組織中含有大量的透明質(zhì)酸，單用膠原酶Ⅳ很難消化完全，需添加透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化方可行。3鏡下可見(jiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，可呈無(wú)序生長(zhǎng)，呈渦旋狀生長(zhǎng)。4大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法培養(yǎng)的人臍帶

6、間充質(zhì)干細(xì)胞均可穩(wěn)定傳代、凍存、復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖穩(wěn)定。5大塊平鋪法實(shí)驗(yàn)操作上省去了剪碎以及鋪塊等最為繁瑣的過(guò)程，比傳統(tǒng)組織塊法更為簡(jiǎn)便，而以往研究表明，酶消化法操作繁瑣，不如傳統(tǒng)組織塊法簡(jiǎn)單。膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法是酶消化法的一種，同樣操作繁瑣，大塊平鋪法操作明顯較膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法簡(jiǎn)單，且原代培養(yǎng)獲得MSCs的時(shí)間要短于傳統(tǒng)組織塊法，提高了獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的效率;以往研究表明，傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干

7、細(xì)胞細(xì)胞活性要優(yōu)于酶消化法，而大塊平鋪法細(xì)胞活性與傳統(tǒng)組織塊法無(wú)差別，明顯優(yōu)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法;大塊平鋪法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成功率與傳統(tǒng)組織塊法無(wú)差別，且明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法。6應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型表明:CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽(yáng)性表達(dá)，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫