赤芍801調(diào)節(jié)血管炎癥反應(yīng)和血小板活化的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、炎癥反應(yīng)與血小板活化的相互介導(dǎo)及促進，是誘發(fā)動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂、導(dǎo)致急性冠狀動脈綜合征(ACS)等急性心肌缺血事件的重要病理基礎(chǔ)。調(diào)節(jié)血管炎癥反應(yīng)和血小板活化是心血管疾病防治領(lǐng)域研究的焦點之一。環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝途徑合成PGs、TXs、PGI2的重要限速酶，其催化合成的活性物質(zhì)參與血管炎癥反應(yīng)和血小板活化過程。由血管內(nèi)皮細胞釋放粘附分子，促使單核巨噬細胞、淋巴細胞向局部粘附、聚集、浸潤，則是血管炎癥反應(yīng)的顯著特征

2、。赤芍801(PrG)是由中藥赤芍的活性成分沒食子酸經(jīng)酯化反應(yīng)而成的單體藥物，既往藥理研究表明它能對抗花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集，且具有抗炎作用。 本課題分體外實驗、體內(nèi)實驗及臨床研究三部分，分別從細胞、分子、基因、蛋白及整體水平上研究赤芍801對COX代謝通路、白細胞與內(nèi)皮細胞粘附、炎癥因子、血小板活化和血栓形成的影響，并用于非ST段抬高急性冠脈綜合征的治療，為尋找新的、更為有效的通過抗炎、抗血栓形成等環(huán)節(jié)治療冠心病的藥物提供

3、新的思路和方法，并為臨床治療缺血性心臟病提供理論依據(jù)?！　∧康模貉芯砍嗌?01對環(huán)氧合酶代謝通路及血管內(nèi)皮細胞(VEC)與多形核白細胞(Polymorphonuclearleukocyte,PMN)粘附的影響。 方法：采用基于小鼠腹腔巨噬細胞的COX-1和COX-2體外篩選模型，用鈣離子導(dǎo)入劑(CalciumionophoreA23187)短時刺激小鼠腹腔巨噬細胞，放免法(RIA)測定培養(yǎng)上清液中的6-酮-前列腺素F1α(6-

4、keto-PGF1α)的量反映COX-1活性；用脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)長時間刺激細胞，測定培養(yǎng)上清液中的前列腺素E2(PGE2)的量反映COX-2活性。半定量RT-PCR法檢測PrG對LPS刺激的Raw小鼠巨噬細胞COX-1、COX-2mRNA表達的影響。Westernblotting法檢測PrG對LPS刺激的Raw小鼠巨噬細胞COX-1、COX-2蛋白表達的影響。同時以TNF-α為刺激物，造成人內(nèi)皮細

5、胞炎癥模型。孟加拉玫瑰紅活細胞染色法測定PMN與VEC黏附率，流式細胞術(shù)檢測內(nèi)皮細胞表面ICAM-1、E-selectin表達。 結(jié)果：PrG體外1×10-5、5×10-6mol·L-1濃度下不影響6-keto-PGF1α生成(P＞0.05)，而在1×10-6至5×10-8mol·L-1濃度下則誘導(dǎo)6-keto-PGF1α生成(P＜0.001)，并呈較好的劑量依賴性。PrG體外1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-

6、1可抑制PGE2生成(P＜0.05)。PrG(0.001mM-5mM)可不同程度抑制內(nèi)皮細胞與PMN的粘附，PrG在5mM、2mM、1mM濃度下可不同程度地抑制HUVEC表面ICAM-1、E-selectin表達，呈劑量依賴性。較低濃度PrG(100uM-1uM)對HUVEC表面ICAM-1表達無明顯影響，對HUVEC表面E-selectin表達略有增加的趨勢(但P＞0.05)。10mMASA對HUVEC表面ICAM-1、E-selec

7、tin陽性表達率無明顯影響(P＞0.05)。 結(jié)論：在1×10-5到5×10-8mol·L-1濃度范圍內(nèi)，PrG低濃度時激活COX-1，高濃度時抑制COX-2，但不影響COX-1、COX-2mRNA表達；PrG可抑制COX-2蛋白表達，但對COX-1蛋白表達無明顯影響。高濃度PrG(0.1-1mM)是有效的人PMN與HUVEC粘附的抑制劑，作用機理可能與抑制HUVEC表面ICAM-1、E-selectin表達有關(guān)，其有效作用濃度

8、低于ASA?！　∧康模河^察赤芍801對大鼠實驗性頸動脈血栓形成模型血栓形成時間及凝血和纖溶系統(tǒng)的影響。 方法：SD大鼠隨機分為4組：生理鹽水對照組、肝素組(1250IU/Kg靜脈注射)、PrG小劑量組(30mg/Kg靜脈注射)、PrG大劑量組(60mg/Kg靜脈注射)，各組均于電刺激前30min給藥。直流電連續(xù)刺激頸總動脈造成大鼠頸動脈血栓形成模型，記錄自通電刺激至頸總動脈溫度突降時間，作為血栓形成時間，ELISA法測定血漿組

9、織纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)水平。 結(jié)果：PrG30mg/Kg、60mg/Kg均可延長大鼠動脈血栓形成時間，但明顯弱于肝素(P＜0.05)。PrG30mg/Kg、60mg/Kg與生理鹽水對照組相比，有升高t-PA/PAI的作用趨勢，但P＞0.05。 結(jié)論：PrG有一定的抗大鼠實驗性頸動脈血栓形成的作用，并可輕度調(diào)節(jié)血漿t-PA/PAI比值失衡。　　目的：觀察赤芍801對急性心肌梗

10、死大鼠血清炎性因子及缺血心肌COX-2、ICAM-1蛋白表達的影響。 方法：結(jié)扎冠脈左前降支造成造成大鼠急性心肌梗死模型，以標(biāo)準肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段弓背抬高示AMI形成。大鼠隨機分為6組：正常對照組、假手術(shù)組、模型組(又分梗死后24h，3d，7d三個亞組)、赤芍801大劑量組(80mg·kg-1·d-1ip)、赤芍801小劑量組(40mg·kg-1·d-1ip)、阿斯匹林對照組(25mg·kg-1·d-1ig)，共給藥7天。放免

11、法檢測血清IL-1β、TNF-α含量，免疫組化法檢測心肌組織COX-2、ICAM-1表達。 結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α水平明顯升高，但IL-1β水平升高無顯著差異。模型組缺血區(qū)心肌組織COX-2、ICAM-1表達于24小時開始升高，7天時達最高峰。與模型組相比，赤芍801小劑量組可降低血清TNF-α水平，輕度抑制缺血心肌組織COX-2、ICAM-1表達。 結(jié)論：赤芍801小劑量組可減輕急性心肌梗死大鼠炎癥因子

12、TNF-α水平，輕度抑制缺血心肌組織COX-2、ICAM-1表達?！　∧康模河^察注射用赤芍801聯(lián)合西醫(yī)標(biāo)準藥物治療對非ST段抬高急性冠脈綜合征患者的療效及血清炎癥標(biāo)志物和血小板活化的影響。 方法：選擇符合入選標(biāo)準的UA/NSTMI患者55例，在西醫(yī)標(biāo)準藥物治療的基礎(chǔ)上，隨機分為注射用赤芍801治療組(27例)和注射用丹參對照組(28例)，均連續(xù)用藥14天。采用流式細胞術(shù)檢測患者治療前后血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb-Ⅲa受體，C

13、D62P受體表達陽性率及平均熒光強度(MFI)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測患者治療前后血中炎癥標(biāo)志物高敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)水平。 結(jié)果：兩組心絞痛有效率和心電圖有效率無顯著差異，兩組治療后血清Hs-CRP水平、GPⅡb-ⅢaMFI、CD62P陽性率均較治療前明顯降低(P＜0.05)，赤芍801組與丹參對照組比較，有進一步降低血清Hs-CRP水平及GPⅡb-ⅢaMFI的趨勢，但差別無顯著意義。 結(jié)論：在西醫(yī)標(biāo)

14、準藥物治療的基礎(chǔ)上加用注射用赤芍801或丹參粉針兩組療效及對血清炎癥標(biāo)志物Hs-CRP和血小板活化的影響無顯著差異。與丹參對照組比較，赤芍801組有進一步降低血清Hs-CRP水平及GPⅡb-ⅢaMFI的作用趨勢。　　綜上所述，本研究在既往推測PrG作用環(huán)節(jié)可能是在環(huán)氧酶的基礎(chǔ)上，建立了分別基于小鼠巨噬細胞和人內(nèi)皮細胞的兩種體外COX-1和COX-2抑制劑篩選模型，證明了PrG是COX-2活性水平和蛋白表達水平的抑制劑，但低濃度(＜1μ

15、M)對COX-1活性呈促進作用。通過建立內(nèi)皮細胞炎癥模型，證明高濃度PrG(＞0.1mM)是有效的人PMN與HUVEC粘附的抑制劑，作用機理可能與高濃度時抑制HUVEC表面ICAM-1、E-selectin表達有關(guān)，其有效作用濃度低于ASA。并通過建立大鼠實驗性頸動脈血栓形成模型和急性心肌梗死模型，在體內(nèi)驗證了PrG具有一定的抗血栓形成、減輕炎癥因子TNF-α釋放和抑制缺血心肌COX-2表達的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合西醫(yī)標(biāo)準藥物治療的基