生理劑量睪酮對小鼠行為學及血管炎癥反應的干預研究.pdf

1、據(jù)2000年11月第五次人口普查表明我國65歲以上老年人口已達8811萬人,占總?cè)丝?.96％,60歲以上人口達1.3億,占總?cè)丝诘?0.2％,按國際標準衡量,我國已經(jīng)進入老年化社會。我國老齡化速度不僅快于全國總?cè)丝谠鲩L速度、快于世界老齡化速度,而且快于經(jīng)濟發(fā)展速度,呈現(xiàn)了“未富先老”的特征。重視老年化疾病,針對老年化疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制及其干預的研究對個人及社會經(jīng)濟和結(jié)構(gòu)都有重要的意義。眾多的流行病學研究均發(fā)現(xiàn),女性的平均壽命長于男

2、性。老年化疾病,如老年癡呆癥、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生率在兩性之中存在較大差異。此外,以女性為例,女性在絕經(jīng)期前后的健康狀況及眾多疾病的發(fā)生發(fā)展也有顯著的不同。這表明雌、雄激素的不同、性激素水平的不同都可能對人老化進程產(chǎn)生不同的影響。
　　 在雄性激素對衰老及心血管疾病發(fā)生發(fā)展進程的相關(guān)研究中,已有眾多研究較為一致的表明體內(nèi)雄激素分泌水平明顯下降的老年人,以及長期體內(nèi)雄激素水平過高的內(nèi)分泌疾病患者均表現(xiàn)出顯著的病

3、態(tài),而生理劑量雄激素相關(guān)的研究卻存在眾多分歧,其一個重要的因為就在于雄激素有著大量的,且生理效應差別甚大的下游產(chǎn)物。所以,本研究著重于生理劑量睪酮及其核受體途徑展開討論。
　　 腦老化是衰老的主要方面之一,可表現(xiàn)為活動能力、學習記憶能力等方面的下降。在利用嚙齒類動物進行的性激素與大腦功能關(guān)系的研究表明兩者之間存在顯著相關(guān),但結(jié)論尚不一致。性激素在體內(nèi)眾多的具有生理活性的下游代謝產(chǎn)物造成了研究的復雜性。有研究表明大腦的雄性化發(fā)育與

4、體內(nèi)睪酮(T)水平顯著相關(guān),其中一些實驗顯示這種雄性化發(fā)育是通過T芳香化代謝為雌二醇(E2)后再通過雌激素受體(ER)而產(chǎn)生的。但如果大腦的雄性化特征是最終由T轉(zhuǎn)化為E2通過ER實現(xiàn)的,那么在評價嚙齒類動物大腦功能的實驗中雄、雌鼠的表現(xiàn)應該相近,但在水迷宮等行為學實驗中,雄鼠、雌鼠的行為學結(jié)果差異甚大,而很多后續(xù)的研究表明雄鼠大腦的雄性化形成是不會被芳香化為E2,且與AR親和性更高的雙氫睪酮(DHT)的作用結(jié)果,并且是通過雄激素受體(A

5、R)實現(xiàn)的。
　　 在證明工具有血管炎癥保護效應的眾多文獻中,分歧在于T的這種保護效應是否是通過轉(zhuǎn)化為E2來實現(xiàn)的,不少實驗采用不會轉(zhuǎn)化為E2的DHT,證明T的保護效應并非通過E2實現(xiàn),但也有很多文獻顯示ER異常的男性患者與內(nèi)皮功能紊亂有關(guān),動脈粥樣硬化(AS)是一種血管炎性疾病,內(nèi)皮功能的紊亂是AS炎癥的起始點,所以這些文獻仍能提示T轉(zhuǎn)化為雌激素后對血管的炎性反應起著重要作用。
　　 在各種炎癥反應中,前列腺素E2(P

6、GE2)、一氧化氮(NO)是內(nèi)毒素血癥和炎癥反應的重要調(diào)節(jié)分子,可擴張血管,升高組胺水平,增加血管壁通透性,促進炎癥滲出,加重炎癥反應。尤其是在炎癥發(fā)生早期炎癥細胞遷移到炎癥部位的過程中。在炎癥發(fā)生過程中,可誘導中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞的相互作用,造成血流動力學改變和器官損傷;也可直接誘導靶器官中細胞凋亡,引起器官功能衰竭。在我們的實驗中,以PGE2、NO為評價炎癥的指標。
　　 本實驗中采用的睪丸女性化(tfm)小鼠是一種由基

7、因突變導致不能表達正常活性的AR的小鼠,其體內(nèi)T水平只有正常小鼠的10％-20％,而且睪丸不能正常發(fā)育,其外生殖器表現(xiàn)與雌鼠相同,所以tfm小鼠是一種觀察經(jīng)典AR功能的理想動物模型。本研究的目的在于采用tfm小鼠觀察在AR缺乏的情況下大腦功能會發(fā)生何種變化,以及在予以內(nèi)毒素(LPS)刺激的情況下,觀各組之間血管對炎癥刺激物反應的不同,來判斷經(jīng)典的AR途徑所發(fā)揮的作用。
　　 D半乳糖(D-gal)是我國最常用的一種衰老模型制作藥

8、物,D-gal在體內(nèi)被還原成半乳糖醇后不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內(nèi),影響滲透壓導致細胞腫脹,代謝紊亂,氧自由基等水平增加。這一過程類似于機體衰老過程,故多用于衰老模型的制作。本實驗用D-gal制成亞急性衰老模型,觀察T通過AR對小鼠的衰老程度發(fā)揮何種效應。
　　 因此,我們進行了以下三個方面進行研究:
　　 一、生理劑量的T對亞急性衰老小鼠行為學的影響
　　 以目前公認的行為學檢測指標:避暗穿梭實驗和水迷宮

9、實驗來評價小鼠大腦學習記憶能力,并觀察大腦海馬CA1區(qū)形態(tài)學的相應改變。分組為正常組、去勢組、去勢+D-gal(去勢+D)組、去勢+D-gal+T(去勢+D+T)組。摘除6周齡雄性C57小鼠雙側(cè)睪丸,制作成T水平顯著下降的去勢小鼠模型,之后每天于頸背部皮下注射900mg/kg的D-gal制作成促衰老小鼠模型模擬T水平顯著下降的老年男性,促衰老小鼠模型予以頸背部皮下注射1mg/kg丙酸睪酮為干預因素。動物模型制備3個月之后于每天上午09:

10、00-11:30之間做小鼠行為學測試,評價其學習記憶能力。之后處死小鼠,取小鼠大腦海馬CA1區(qū)制作病理切片,觀察其形態(tài)學變化,并檢測各組小鼠大腦組織MDA、SOD水平的差異。
　　 結(jié)果顯示去勢及促衰老小鼠的行為學能力顯著低于正常組小鼠,海馬CA1區(qū)的細胞形態(tài)及細胞數(shù)量也顯著劣于正常組。而去勢+D+T組小鼠的行為學測試結(jié)果較去勢組和去勢+D組有顯著好轉(zhuǎn),大腦組織MDA、SOD水平,海馬CA1區(qū)的細胞形態(tài)、排列及細胞數(shù)量也優(yōu)于去勢

11、組和去勢+D組,并與正常組之間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 由此可認為生理劑量的丙酸睪酮可以改善亞急性衰老小鼠的行為學能力,這種作用可能與大腦組織氧自由基水平的下降,CA1區(qū)細胞數(shù)量及形態(tài)的改善有關(guān)。
　　 二、AR在生理劑量T對小鼠學習記憶能力的效應中的作用
　　 為進一步探討T-AR途徑在T對小鼠學習記憶能力效應中所發(fā)揮的作用,我們采用睪丸女性化(tfm)小鼠,這是一種由基因突變導致不能表達正常AR,且體內(nèi)T分

12、泌水平明顯下降的小鼠。我們將生理劑量T同時干預tfm小鼠和去勢C57小鼠,比較其學習記憶能力、大腦海馬CA1區(qū)Niss1染色的病理學變化,推斷AR在其中發(fā)揮的作用。我們同樣制作正常組小鼠、去勢小鼠、去勢+T組小鼠以及tfm組小鼠和tfm+T組小鼠。模型之后3個月后固定于每日上午09:00-11:30時間段內(nèi)進行各組小鼠的自主活動能力、避暗穿梭和水迷宮實驗檢測,之后處死小鼠,取大腦海馬CA1區(qū)切片制作Niss1染色切片,比較各組小鼠海馬區(qū)

13、的形態(tài)學及細胞數(shù)量變化
　　 與第一項實驗相同,去勢組小鼠的學習記憶能力顯著低于正常組,去勢+T組則明顯好轉(zhuǎn),而tfm組小鼠和tfm+T組小鼠的學習記憶能力及海馬CA1區(qū)細胞數(shù)均劣于正常組,與去勢組無明顯差異,且tfm組小鼠與tfm+T組小鼠之間的各項指標之間的差異無統(tǒng)計學差異。
　　 在缺乏有活性AR的情況下,即使補充了體內(nèi)正常水平的T也不能改善其大腦學習記憶能力及海馬CA1區(qū)形態(tài)學,這提示T可以恢復小鼠大腦學習記憶能

14、力、增加小鼠自主活動能力,改善海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)及增加神經(jīng)元數(shù)量的效應是T通過經(jīng)典AR途徑來實現(xiàn)的
　　 三、生理劑量T通過AR途徑對小鼠血管炎癥反應的影響
　　 在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中,血管內(nèi)的炎癥反應屬于關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,所以在第三部分中,我們探討了生理劑量T通過AR途徑在外源性LPS刺激下對小鼠血管炎癥反應的影響。和第二部分一樣,建立正常組、去勢組、去勢+T組、tfm組及tfm+T組小鼠。模型建立3個月后在麻醉無菌

15、操作下取出小鼠胸主動脈并一分為二,在37℃,5％CO2濃度的孵箱內(nèi)置于DMEM中培育30min中后分別置于加或未加LPS的DMEM中孵育6小時,之后再更換新的DMEM液孵育30min,并留取該DMEM液。用ELISA檢測各DMEM中PGE2的釋放量、用比色法檢測DMEM中的NO釋放量,加LPS的DMEM中的指標水平減去相應未加LPS的DMEM中的指標水平,即是受LPS刺激后血管釋放入DMEM中的PGE2、NO的量。再取小0鼠腹主動脈,用

16、生理鹽水制作成10％的組織勻漿,用MDA、SOD比色法檢測試劑盒檢測血管氧自由基水平。通過各組間血管炎癥因子表達水平的差異,推測生理劑量T、AR在其中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果提示去勢組小鼠的炎癥水平及氧自由基水平顯著高于正常組,而去勢+T組小鼠的炎癥水平則明顯下降,與正常組無統(tǒng)計學差異。tfm組及tfm+T組各項指標最低,其中tfm+T組的炎癥及氧自由基水平顯著低于去勢+T組。而tfm+T組血管的炎癥反應及氧自由基則弱于tfm

17、組小鼠,其差異有統(tǒng)計學差異。
　　 由此提示失去生理劑量的T后小鼠血管在外源性炎癥刺激下會產(chǎn)生更強烈的嚴重反應,在無活性AR的情況下,補充生理劑量T的tfm+T組小鼠血管損傷程度不僅弱于tfm,而且也弱于去勢+T組。
　　 通過本研究,我們能夠得出以下結(jié)論:
　　 1.生理劑量的T能增加小鼠自主活動能力,有利于維持小鼠的學習和記憶能力,也可改善亞急性衰老小鼠的學習記憶能力。這種效應可能與降低小鼠大腦組織氧自由基、

18、改善大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、增加神經(jīng)元數(shù)量有關(guān)。
　　 2.生理劑量T對小鼠學習記憶能力的改善作用可能是通過經(jīng)典的AR發(fā)揮作用的。在不表達有活性AR的情況下,體內(nèi)T水平無論低于或達到生理水平都不能發(fā)揮這種效應。
　　 3.生理劑量的T可以減弱外源性炎癥刺激誘發(fā)的小鼠血管炎癥反應程度和氧自由基水平,與表達正常AR的小鼠比較,不表達有活性AR的小鼠中這種效應更明顯。故可推測AR途徑會加重炎癥反應,丙酸睪酮減弱血管炎癥反應