一體化ACECM-HAp雙相支架構(gòu)建與骨軟骨界面組織工程應(yīng)用.pdf

1、研究背景:隨著社會人口老齡化及運動損傷的增多,骨關(guān)節(jié)病變的發(fā)生率在不斷上升,嚴(yán)重影響著人類生活質(zhì)量。引起骨軟骨損傷的相關(guān)病因很多,包括各種退變性疾病以及創(chuàng)傷性損害,隨著年齡增加,軟骨組織的自然磨損易導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生,是骨軟骨損害的主要原因。關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨共同構(gòu)成了一個相互依存的復(fù)合功能單元,兩者在解剖結(jié)構(gòu)上緊密相連,生物學(xué)功能相互影響。該功能單元具有材料梯度和生理特異的組織結(jié)構(gòu),不同層面的力學(xué)屬性、新陳代謝及分子運輸均有差異,尤其軟

2、骨與骨之間的骨軟骨界面起著承上啟下的屏障作用。骨軟骨損傷同時累及關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨,兩者不同的組織成分和力學(xué)性能充分顯示出其組織界面的重要性,骨軟骨界面在防止力學(xué)失效和維護軟骨的正常功能是必需的,因此對骨軟骨缺損的修復(fù)必須同時考慮骨、軟骨和骨軟骨界面。目前組織工程策略的難點在于兩種不同組織之間界面無縫連接的仿生結(jié)構(gòu)設(shè)計,這使得骨軟骨一體化再生成為了臨床和科研的熱點議題。因此,骨軟骨組織工程界面的開發(fā)將成為創(chuàng)傷性骨軟骨缺損和退變性關(guān)節(jié)疾病

3、治療的新策略。本研究包括以下內(nèi)容:(1)探討骨軟骨缺損修復(fù)進程中軟骨下骨重塑與軟骨再生的關(guān)系;(2)開發(fā)含有仿生界面的一體化雙相支架;(3)體外評估雙相支架的特征及生物學(xué)行為;(4)細(xì)胞復(fù)合支架體內(nèi)修復(fù)骨軟骨缺損及再生骨軟骨界面的作用機制探索。
　　方法:(1)取成年健康新西蘭大白兔,制備股骨滑車溝骨軟骨缺損自發(fā)性修復(fù)模型,于術(shù)后1、4、12、24周分別取材,行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,根據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會組織學(xué)評分(I

4、CRS)量化評估,顯微計算機斷層掃描(Micro-CT)掃描重建分析軟骨下骨的組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)。(2)基于前期研究成果,選用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ACECM)和羥基磷灰石(HAp)納米顆粒配比,運用物理濕法粉碎及脫細(xì)胞技術(shù)、“液相合成擴散(LPCI)”技術(shù)、改良熱致相分離(TIPS)技術(shù)、物理與化學(xué)交聯(lián)和冷凍干燥等多項技術(shù)構(gòu)建包含非礦化相和礦化相及連續(xù)界面的一體化仿生支架,并對其理化表征進行檢測以及生物力學(xué)與滲透特性進行評估。(3)將種

5、子細(xì)胞種植于雙相支架中體外構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合物并進行系列檢測,觀察細(xì)胞在雙相支架中粘附、增殖及生長分布情況,并將細(xì)胞支架復(fù)合物植入小鼠背部皮下,進行活體熒光成像及組織學(xué)檢測。(4)將種子細(xì)胞以不同方式種植于 ACECM/HAp雙相支架上體外構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合物,植入兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損,術(shù)后于4、12、24周不同時間點分次取材,對標(biāo)本進行大體觀察、組織學(xué)染色及量化評分、生化定量檢測、Micro-CT掃描及生物力學(xué)評估。
　　結(jié)果:(

6、1)骨軟骨損傷模型隨時間延長可不同程度自發(fā)性修復(fù),缺損區(qū)逐漸被修復(fù)組織填充平整,缺損區(qū)內(nèi)軟骨下骨板逐漸向上遷移。骨礦物質(zhì)密度、骨體積分?jǐn)?shù)、組織礦化密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度均逐漸增加,而骨小梁間隙寬度逐漸下降;軟骨組織學(xué)表現(xiàn)為纖維性修復(fù)為主,透明軟骨少見;隨時間延長,術(shù)后ICRS組織學(xué)評分逐漸增加;軟骨下骨相關(guān)組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)中,除骨小梁間隙寬度與ICRS組織學(xué)評分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.584)外,其它各參數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.680

7、~0.891),但軟骨下骨重塑與軟骨修復(fù)的進程并不完全同步。(2)實驗采用ACECM和納米HAp兩種不同材料,結(jié)合運用改良TIPS及LPCI等技術(shù),成功制備出含有礦化層與非礦化層及連續(xù)界面的雙相支架,界面處有良好的結(jié)構(gòu)的完整性,支架上層孔結(jié)構(gòu)呈微管樣具有良好的孔間連通性,垂直方向呈平行取向排列,而下層內(nèi)呈隨機排列。兩層內(nèi)各自的微孔結(jié)構(gòu)相對均勻,但孔徑和孔隙率存在明顯差異(P<0.05),呈“上大下小,上疏下密”的特征,兩層孔徑的變化從1

8、28.2±20.3μm縮小至21.2±3.1μm,上層的孔隙率為92.6±6.2％,而礦化層的孔隙率因HAp含量的增加而從44±3.2%降至30±4.1%。掃描電子顯微鏡(SEM)示,孔形態(tài)逐漸由管型變?yōu)閳A形,呈現(xiàn)出類似天然骨軟骨界面的過渡結(jié)構(gòu)。力學(xué)試驗顯示支架具有良好的抗壓縮及界面抗剪切性能,且界面區(qū)具有低滲透率的物理屏障作用,其中7w/v%的HAp為最適宜的支架配比濃度。(3)體外實驗CCK-8檢測和SEM觀察顯示軟骨細(xì)胞及BMSC

9、s在支架上層有良好的粘附和增殖,組織學(xué)、SEM觀察及共聚焦熒光顯微鏡下觀察均顯示ACECM/HAp雙相支架對細(xì)胞的分布起著導(dǎo)向作用和屏障作用,細(xì)胞在支架上層內(nèi)沿孔道排列分布,未見細(xì)胞穿越界面進入下層內(nèi)。界面區(qū)域未見分層現(xiàn)象,可提供適宜細(xì)胞增長的微環(huán)境。細(xì)胞-支架復(fù)合物的活性評估和皮下埋植實驗顯示支架上層保留了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要的成分具有軟骨誘導(dǎo)性,下層含有鈣磷等礦物質(zhì)成分具有骨引導(dǎo)性,界面區(qū)的低滲透性具有阻隔效應(yīng),且無細(xì)胞毒性,具備

10、良好的生物相容性。(4)體內(nèi)試驗組織學(xué)染色結(jié)果顯示成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs或軟骨細(xì)胞復(fù)合ACECM/HAp雙相支架組修復(fù)效果優(yōu)于對照組(P<0.05),尤其術(shù)后24周,修復(fù)區(qū)軟骨厚度恢復(fù)正常,基質(zhì)染色正常,新生軟骨及周圍軟骨細(xì)胞形態(tài)正常,骨軟骨界面及潮線再生,軟骨下骨重建完成與周圍骨組織完全整合;壓痕力學(xué)試驗結(jié)果顯示24周時新生軟骨具有良好的楊氏模量,與正常軟骨比較無差異(P>0.05);Micro-CT掃描觀察發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量的軟骨下骨形成;

11、觀察期內(nèi)植入物無一脫落,顯示支架植入時具有良好的初始穩(wěn)定性。
　　結(jié)論:(1)自發(fā)性骨軟骨修復(fù)進程中,軟骨下骨重塑與軟骨再生密切相關(guān)且獨立發(fā)生,軟骨下骨的快速重塑可能負(fù)面影響關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果。(2)選取納米ACECM和HAp材料,采用系列優(yōu)化技術(shù),以天然全層骨軟骨組織的結(jié)構(gòu)作為模板,遵循“一體化”分層支架的設(shè)計,成功構(gòu)建出用于骨軟骨界面組織工程的新型雙相支架。雙相支架上層為非礦化的大孔取向結(jié)構(gòu),下層為礦化的小孔蜂窩結(jié)構(gòu),兩層間的界

12、面以嵌合錨定的方式一體化整合,且具有良好的抗壓縮和抗剪切性能。支架界面具有低滲透效應(yīng)可提供上下兩層區(qū)域各異的特征,此具有成分-結(jié)構(gòu)-功能仿生的雙相支架符合界面組織工程的要求。(3)ACECM/HAp雙相支架具備空間導(dǎo)向控制細(xì)胞分布的能力,可提供適合種子細(xì)胞增殖和軟骨再生獨特的微環(huán)境,具有良好的細(xì)胞和組織相容性。支架生化成分及結(jié)構(gòu)具有雙相仿生的特性,并具備獨特的界面阻隔效應(yīng),在體外能形成穩(wěn)定連續(xù)的組織界面,可模擬骨軟骨界面的組織特性,適合