不同成分供者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)非清髓小鼠異基因骨髓移植的影響.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(allogenichematopoiesisstemcelltransplant，allo-HSCT)是治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的一種有效治療手段。allo-HSCT需要人類白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)配型相合供者。HLA不合的程度越高，植入成功的機(jī)會(huì)越低，植入后移植物抗宿主反應(yīng)(graftversushostdisease，GVHD)發(fā)生率越高、移植相關(guān)并發(fā)癥及病死

2、率越高、長期生存率越低。對(duì)供者選擇的順序首先選擇同胞間HLA基因型完全相合者，其次是HLA表型相合的家庭成員。然而由于人類基因的復(fù)雜性，同胞之間HLA相合機(jī)率僅25％，加上單子女家庭在不斷增多，在家庭成員中找到HLA完全相合供者的機(jī)會(huì)越來越少。即使在西方，配型相合的同胞兄弟姐妹(HLA-matchedsibling，HLA-MS)的比率也僅有約30％，其供/受者主要來自無血緣關(guān)系者[1]。因此，這類移植中，選擇替代供體是當(dāng)務(wù)之急。替代供

3、體主要有HLA相合無血緣關(guān)系供體和HLA不完全相合的親屬供體。尋找無血緣關(guān)系供體需要較長的時(shí)間和較多的費(fèi)用，很多患者因無法長時(shí)間等待而失去移植機(jī)會(huì)。另一方面，幾乎所有患者都有HLA部分相合的家庭成員(父母和子女之間)可作供體。存在于供者移植物中的成熟T細(xì)胞具有識(shí)別異己抗原的作用，并由此誘發(fā)GVHD。GVHD是allo-HSCT的主要并發(fā)癥和導(dǎo)致死亡的原因，特別是急性GVHD，是allo-HSCT成功的主要障礙。GVHD是主要由T細(xì)胞介導(dǎo)

4、的反應(yīng)，首先供者T細(xì)胞接觸并識(shí)別受者抗原發(fā)生克隆性增殖，或者通過T細(xì)胞直接識(shí)別受者靶細(xì)胞的MHC，或間接分泌細(xì)胞因子引起組織損傷。移植方案，特別是含照射的方案，炎癥因子的釋放，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)，“細(xì)胞因子風(fēng)暴”放大供者T細(xì)胞對(duì)異體抗原的效應(yīng)，導(dǎo)致GVHD的發(fā)生。由于供者T細(xì)胞同時(shí)具有促進(jìn)造血干細(xì)胞的植入、促進(jìn)免疫重建、降低EB病毒相關(guān)的淋巴增生性疾病和清除腫瘤殘余病灶的作用，即移植物抗白血病(graft-

5、versusleukemia，GVL)或移植物抗腫瘤(graft-versus-tumor，GVT)作用。因此，去除T細(xì)胞的移植雖然可以有效地預(yù)防嚴(yán)重的GVHD，但具有移植失敗率高，免疫重建差，易并發(fā)嚴(yán)重感染以及復(fù)發(fā)率高的風(fēng)險(xiǎn)[2]。一些研究發(fā)現(xiàn)死于GVHD的患者中，T細(xì)胞庫的90％以上的細(xì)胞為擴(kuò)增的T細(xì)胞，且白血病細(xì)胞與GVHD引起的T細(xì)胞克隆不同，因此為GVL和GVHD可分離提供了分子學(xué)證據(jù)。所以，選擇性地去除針對(duì)宿主移植抗原的T細(xì)

6、胞，而保留其余的T細(xì)胞，不但可以避免GVHD，而且可以保存其保護(hù)性的細(xì)胞免疫功能。同樣，引入并發(fā)展的供者淋巴細(xì)胞輸注(Donorlymphocytesinfusion，DLI)的細(xì)胞免疫治療，雖能誘導(dǎo)宿主對(duì)抗移植物反應(yīng)的耐受，并介導(dǎo)GVL和GVT效應(yīng)，但仍具有不可避免的GVHD風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何在介導(dǎo)最有效的GVT的同時(shí)避免嚴(yán)重GVHD的產(chǎn)生是目前研究的熱點(diǎn)。本課題即瞄準(zhǔn)這一難點(diǎn)，建立主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocomtab

7、ilitycomplex，MHC)不相合的小鼠亞移植模型，觀察其抗腫瘤作用并探討移植耐受及GVT作用機(jī)理，以期探索腫瘤免疫治療的新途徑，為惡性血液病、實(shí)體瘤以及一些遺傳性疾病的治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)Ⅰ不同成分淋巴細(xì)胞輸注對(duì)非荷瘤鼠的非清髓異基因骨髓移植的影響目的建立小鼠非清髓異基因骨髓干細(xì)胞移植模型，探討不同成分的DLI對(duì)移植效果的影響并探討其機(jī)制。方法受者鼠為Balb/c小鼠，供者鼠為C57b1/6小鼠，依據(jù)DLI的不

8、同將受者鼠隨機(jī)分為(A、B、C、D和E組)5組，每組5只。5組均給予預(yù)處理，A組預(yù)處理后于移植d1給予供者小鼠全脾細(xì)胞1.0×107個(gè)；B組分別于移植后d1、7、14給予供者小鼠全脾細(xì)胞0.3×107個(gè)；C組于移植后d1、7給予去除CD8+細(xì)胞供者鼠脾細(xì)胞0.5×107個(gè)；D組于移植后d1、7給予供者鼠全脾細(xì)胞0.5×107個(gè)，E組為對(duì)照組，只接受預(yù)處理，不接受干細(xì)胞移植及DLI處理。觀察各組嵌合狀態(tài)、造血恢復(fù)情況、GVHD。結(jié)果移植組

9、(A、B、C、D組)小鼠嵌合率均在80％以上，明顯高于未移植組；除C組一只小鼠死亡外其余均存活，白細(xì)胞于d7降到最低，并于移植后d20左右自行獲得造血恢復(fù)，但C組白細(xì)胞水平低于2.0×109/L持續(xù)時(shí)間較其它組長，造血恢復(fù)明顯比其余組慢，GVHD評(píng)分C組最高，A、B組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.173)，C、D組間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.033)。結(jié)論建立非清髓小鼠異基因骨髓干細(xì)胞移植模型條件適宜，且去除CD8+細(xì)胞的DLI移植后GV

10、HD比未去除組要嚴(yán)重，移植效果相對(duì)較差。 實(shí)驗(yàn)Ⅱ不同成分淋巴細(xì)胞輸注對(duì)荷瘤鼠的非清髓異基因骨髓移植的影響目的建立荷瘤小鼠非清髓異基因骨髓干細(xì)胞移植模型，探討不同成分的DLI對(duì)移植效果的影響及抗腫瘤機(jī)制。方法受者鼠為Balb/c(H2Kd)小鼠，供者鼠為C57bl/6(H-2Kb)小鼠，給受者小鼠腹腔接種小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞，觀察腹水生成情況及生存狀況。預(yù)處理于接種瘤細(xì)胞后d5進(jìn)行，隨后給受者小鼠尾靜脈輸注供者鼠的骨髓細(xì)胞，建

11、立荷瘤小鼠的MHC不相合亞移植模型。依據(jù)不同DLI將荷瘤鼠受者鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組10只。A、B、C、D組均給予預(yù)處理，A組預(yù)處理后于移植d1、7給予供者小鼠全脾細(xì)胞0.5×107個(gè)；B組分別于移植d1、7給予去除CD8+細(xì)胞供者鼠脾細(xì)胞0.5×107個(gè)；C組于移植d1、7給予去除CD4+細(xì)胞供者鼠脾細(xì)胞0.5×107個(gè)；D組只接受預(yù)處理不作移植及DLI；E組為荷瘤對(duì)照組，既不接受作預(yù)處理，也不接受干細(xì)胞移植及DLI。觀

12、察各組成瘤率、生存期、嵌合狀態(tài)、造血恢復(fù)情況及GVHD。結(jié)果所有小鼠均產(chǎn)生腹水，成瘤率100％；生存期C組最長為35.6±3.1天，B組為23.7±10.9天，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；接受移植的A、B、C組嵌合率均高于80％；只接受預(yù)處理的D組鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)自行恢復(fù)正常；GVHD評(píng)分C組與B組有明顯差異(P＜0.05)。結(jié)論建立非清髓荷瘤小鼠異基因骨髓干細(xì)胞移植模型條件適宜，去除CD4+細(xì)胞的DLI能夠減輕瘤負(fù)荷，延長荷瘤鼠