microRNAs調(diào)控T淋巴細(xì)胞在小鼠延遲連續(xù)異基因骨髓移植中誘導(dǎo)免疫耐受的作用研究.pdf

1、目的：建立小鼠延遲連續(xù)異基因骨髓移植模型，并探討microRNA(miRNA)在該移植模式中誘導(dǎo)免疫耐受的作用機(jī)制。
　　方法：①小鼠延遲連續(xù)異基因骨髓移植模型的建立:以BALB/c（H-2d）小鼠為受鼠，經(jīng)致死量全身照射（total body irradiation，TBI）后行異基因移植(C57BL/6(H-2b)為移植供鼠），分為4組:空白對(duì)照組（BL，僅TBI）;生理鹽水對(duì)照組(NS，移植相應(yīng)時(shí)間注射生理鹽水);經(jīng)典移植組

2、（BS，TBI后4h內(nèi)移植）及延遲連續(xù)移植組（DS，TBI后第4-7天分次連續(xù)移植）;②差異性表達(dá)的miRNAs篩選及靶基因預(yù)測(cè):提取受鼠脾臟總RNA后行miRNA芯片檢測(cè)，選出差異性表達(dá)的miRNAs，通過miRBase、miRanda及Targetscan三種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選靶基因;③靶基因的鑒定及功能驗(yàn)證:熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miRNAs與靶基因的靶向關(guān)系。qRT-PCR及Western blot檢測(cè)靶基因的mR

3、NA及蛋白水平，進(jìn)一步明確兩者作用關(guān)系。構(gòu)建表達(dá)miRNAs前體的慢病毒(LV-miRNA)及空載體(LV-Ctrl)感染BALB/c(H-2d)小鼠脾臟初始CD4+CD62L+T細(xì)胞（下簡稱CD4+T細(xì)胞），檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖、凋亡情況及CD4+T細(xì)胞亞群，再構(gòu)建靶基因慢病毒載體感染上述細(xì)胞（使細(xì)胞過表達(dá)靶基因），以明確miRNAs通過靶向靶基因?qū)D4+T細(xì)胞的分化影響。
　　結(jié)果：①成功建立小鼠延遲連續(xù)異基因骨髓移植模型:與

4、經(jīng)典移植組相比，延遲連續(xù)移植組受鼠的生存率明顯升高(p＜0.05); aGVHD(acute graft versus hostdisease)評(píng)分明顯下降(p＜0.05);肝臟及腸道病理結(jié)果顯示損傷明顯減輕(p＜0.05); Th1類細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2分泌高峰延遲且下降(p＜0.05);，Th2類細(xì)胞因子如IL-4、IL-10分泌高峰提前且有所升高(p＜0.05);外周血Th2及Treg占CD4+T細(xì)胞比例比例較高(p＜0

5、.05); Th1細(xì)胞較低(p＜0.05);②通過miRNA芯片檢測(cè)，相比較于經(jīng)典移植組，在延遲持續(xù)組中有多個(gè)miRNAs表達(dá)明顯異常（差異1.5倍以上），其中，以miR-19a上調(diào)最明顯。進(jìn)一步通過結(jié)合數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)miRNAs的25個(gè)靶基因參與了TCR等免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，其中包括miR-19a的靶基因Raf1。③熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示miR-19a對(duì)Raf1-3'UTR具有靶向作用(p＜0.05)。過表達(dá)miR

6、-19a后，CD4+T細(xì)胞中Raf1的mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào)(p＜0.05)，說明了miR-19a靶向調(diào)控Raf1。miR-19a過表達(dá)后，CD4+T細(xì)胞的MTS增殖活性減低(p＜0.05)，凋亡實(shí)驗(yàn)提示Annexin V及7-AAD陽性細(xì)胞比例明顯增加(p＜0.05)。CD4+T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果提示過表達(dá)miR-19a后，Th2及Treg比例較高(p＜0.05)，Th1細(xì)胞較低(p＜0.05);而恢復(fù)小鼠CD4+T細(xì)胞的Raf1