iPS細胞來源的嵌合體胸腺移植對異基因骨髓移植小鼠的T細胞重建和GVHD的影響.pdf

1、加快異基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo-BMT)后T細胞重建能夠降低感染和腫瘤復發(fā)的幾率。胸腺移植(thymus transplantation，TT)作為一種提高胸腺功能、加快T細胞重建的方法，已被臨床用于治療DiGeorge綜合征、嚴重聯(lián)合免疫缺陷病、艾滋病等疾病。前期研究顯示，TT聯(lián)合allo-BMT不但能夠促進T細胞重建，加強抗腫瘤效應，而且不會引起嚴重的移植物

2、抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。然而胸腺供體來源缺乏制約了TT在allo-BMT的應用。誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPScells)具有和胚胎干細胞相似的功能，學者們已成功將iPS細胞誘導分化為造血祖細胞、神經(jīng)元、胰島β細胞、肝細胞、血管內皮細胞等。iPS細胞技術為培養(yǎng)人工胸腺提供了新思路。目前國內外尚未有將iPS細胞誘導分化為胸腺并運用于異基

3、因骨髓移植的研究報道。
　　研究目的:
　　本課題組前期研究將表達綠色熒光蛋白的C57BL/6小鼠的iPS細胞，通過顯微注射到ICR小鼠囊胚腔內，獲得的嵌合胚胎移植到代孕雌性ICR小鼠子宮內，最終獲得嵌合子代，用iPS細胞成功構建了嵌合體胸腺。本研究首次將嵌合體胸腺用于allo-BMT時的TT，探索其對受體T細胞重建和GVHD的影響。旨在解決TT的來源，并尋找一種加快allo-BMT后T細胞重建的新方法。
　　研究方法

4、:
　　1.異基因骨髓內骨髓移植、胸腺移植和淋巴細胞輸注異基因骨髓內骨髓移植（intra-bone marrow-bone marrow transplantation,IBM-BMT）:受體BALB/c小鼠移植前24h均接受X射線全身照射。取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨的骨髓細胞(bone marrow cells，BMCs)，制成單細胞懸液。將受體小鼠麻醉，使用微量注射器穿過關節(jié)囊將BMC1×107/mouse注入脛骨骨髓腔

5、內。TT:取嵌合體小鼠胸腺，分離為大小約2×2×1mm的組織塊，暴露受體左側腎臟于體腔外，將胸腺組織塊置于腎被膜下，逐層縫合肌肉及皮膚。淋巴細胞輸注(donorlymphocyte infusion，DLI):取C57BL/6小鼠的脾臟，研磨，計數(shù)，通過鼠尾靜脈注入5×106/mouse脾臟單細胞懸液。
　　2.IBM-BMT+TT組的供體胸腺和各組GVHD的觀察
　　實驗分三組:IBM-BMT組，IBM-BMT+TT組，I

6、BM-BMT+DLI組。移植4周后，取移植的供體胸腺行HE染色，觀察組織學形態(tài)。每周測量小鼠體重2-3次，同時觀察GVHD的表現(xiàn)。取受體小鼠的肝臟、小腸、皮膚，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察其GVHD的病理變化。
　　3.檢測各組T細胞亞群
　　在移植4周后，取受體小鼠外周血，流式細胞儀分析檢查植入狀態(tài)、分析不同實驗組T細胞亞群比例。取脾臟，流式細胞儀分析不同組Foxp3+CD4+T細胞的比例。
　

7、　研究結果:
　　1.IBM-BMT+TT組、IBM-BMT+DLI組、IBM-BMT組外周血CD8+T細胞組比例分別為（11.10±1.49）％，（8.49±0.82）％，（5.52±0.83）％，兩兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。IBM-BMT+TT組的外周血CD4+T細胞比例為（9.60±0.69）％，顯著高于IBM-BMT+DLI組的(8.07±0.65)％及IBM-BMT組(6.42±1.40)％(P＜0.05)

8、。
　　2.IBM-BMT+TT、IBM-BMT組的脾臟Foxp3+細胞占CD4+T細胞比例分別為（1.86±0.36）％、（2.29±0.23）％，顯著高于IBM-BMT+DLI組（0.07±0.05）％(P＜0.05)。
　　3.IBM-BMT+TT、IBM-BMT組的GVHD臨床評分低于IBM-BMT+DLI組，病理學檢查GVHD表現(xiàn)更輕。
　　研究結論:
　　1.iPS細胞來源的嵌合體胸腺移植，通過胸腺依