蛛網(wǎng)膜下腔出血的基礎(chǔ)和臨床研究.pdf

1、本研究旨在從分子生物學(xué)和臨床的角度探討腦蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）發(fā)病機(jī)制，為臨床制定確實(shí)有效的治療方案，改善SAH病人的預(yù)后提供依據(jù)。 第一部分、蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣與內(nèi)皮-氧化氮合酶基因多態(tài)相關(guān)研究。 目的：探討內(nèi)皮一氧化氮合酶基因的已知多態(tài)與蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生腦血管痙攣的相關(guān)性。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組：SAH無(wú)CVS組、ASAH有CVS組、TSAH有CVS組，其中ASAH有CVS組和TSAH有

2、CVS組為實(shí)驗(yàn)組（98+96=194例）、SAH無(wú)CVS組為對(duì)照組（195例）。以家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性研究，為實(shí)驗(yàn)組194例和對(duì)照組100例。 2.全部病人均作如下檢查：包括3D-DSA、CT和TCCD檢查。分別探測(cè)頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈、大腦后動(dòng)脈、基底動(dòng)脈、椎動(dòng)脈。分別記錄各腦動(dòng)脈的收縮峰血流速度，平均血流速度，舒張末期血流速度。三組病人均在出血后的第3天和第7天各檢測(cè)上述指標(biāo)1次。 3.抽血檢查病

3、人DNA，采用兩對(duì)引物：決定T-786C含223個(gè)堿基對(duì)片段的多態(tài)的引物： 上游引物是5’-GCATGCACTCTGGCCTGAAGTG-3'， 下游引物是5’-CAGGAAGCTGCCTTCCAGTGC-3’； 決定外顯子7內(nèi)含267個(gè)堿基對(duì)G894T的置換的片段的引物： 上游引物是5'CTGGAGATGAAGGCAGGAGAC-3' 下游引物是5’-CTCCATCCCACCCAGTCAATC-

4、3'。 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在50μl的總?cè)莘e內(nèi)含80 ng染色體DNA、50pmol的每種引物、200 μmol/L dNTP、1.25U的TAQ FLDNA聚合酶（PGC Scientific Co.，F(xiàn)rederick，MD，USA）和5μl的10 ×PCR buffer緩沖液含15 mmol/L MgCl2（PGC Scientific Co.）。開(kāi)始的變性溫度為94℃反應(yīng)5分鐘、隨

5、后循環(huán)40次在94℃的條件下反應(yīng)1分鐘、55℃反應(yīng)1分鐘和77℃1分鐘。在72℃下延伸5分鐘使擴(kuò)增完成。擴(kuò)增后進(jìn)行印跡：8微升的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入50μL的變性溶液[500 mmol/L NaOH、2.0 mol/L NaCl、25 mmol/L乙二胺四醋酸（EDTA）、0.0001%溴酚藍(lán)]并在真空條件下將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)點(diǎn)印器具上的尼龍膜。轉(zhuǎn)移后將膜浸入2 × NaCl/枸櫞酸鈉溶液80℃下20分鐘吸干。并通過(guò)決定T-786C多態(tài)采用兩

6、個(gè)17個(gè)堿基對(duì)的等位基因特異的寡核苷酸探針：序列為5’-CTGGCCGGCTGACCCTG-3’和5'CTGGCTGGCTGACCCTG-3’決定G894T多態(tài)采用兩個(gè)17個(gè)堿基對(duì)的等位基因特異的寡核苷酸探針，序列如下：5’-GATGAGCCCCCGAACT-3’和5'GATGATCCCCCGAACT-3’進(jìn)行雜交，檢測(cè)內(nèi)皮一氧化氮合酶基因的多態(tài)即基因型和等位基因頻率。 4.進(jìn)行病例對(duì)照研究，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

7、分析：連續(xù)變量比較采用T檢驗(yàn)。在對(duì)照組和兩個(gè)病例組基因型和等位基因頻率比較采用標(biāo)準(zhǔn)卡方檢驗(yàn)。根據(jù)Rothman的方法或分層卡方檢驗(yàn)計(jì)算其優(yōu)勢(shì)比和其可信區(qū)間。 結(jié)論：內(nèi)皮一氧化氮合酶的DNA序列的差異與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生有相關(guān)性。 第二部分、吸煙對(duì)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人腦循環(huán)影響的研究。 目的：探討內(nèi)皮一氧化氮合酶基因?qū)ξ鼰煹膭?dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人的腦循環(huán)的影響。 方法：根據(jù)吸煙量（每

8、年吸煙的量）≥200支和0支分為吸煙組和不吸煙組，其中吸煙組198例，不吸煙組196例。 1.全部病人夜間禁食后收集血漿來(lái)測(cè)量總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯水平。 2.進(jìn)行TCCD檢測(cè)：分別探測(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、大腦中動(dòng)脈（MCA）。分別記錄各腦動(dòng)脈的收縮峰血流速度（Vs），平均血流速度（Vm），舒張末期血流速度（Vd）。三組病人均在出血后的第3天和第7天各檢測(cè)上述指標(biāo)1次。以公式：Vm=Vs+（Vd×2）/3計(jì)算平

9、均流速。 3.從外周血中提取DNA，以 C0：TTT CTC CAG CCC CTC AGA TG； 2684C：GGC AGA GGC AGG GTC AGA CG 2684T：CAT CAA GCT CTT CCC TGT CT T0：AGG CCC AGC AAG GAT GTA GT為引物，采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增：在總?cè)莘e20ul：包括50ng基因組DNA、0.25μmol/L

10、 2684T和2684C啟動(dòng)子、0.063 μmol/L T0和C0啟動(dòng)子、62.5 μmol/L dNTPs、45 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、11 mmol/L硫酸銨、 6.7 μmol/L，β-巰基乙醇、 4.5 μmol/L EDTA、1.5mmol/L MgCl2、和0.4 U Taq聚合酶。起始溫度為96℃，在94℃下30秒、60℃下30秒、72℃下20秒循環(huán)35次完成擴(kuò)增。將內(nèi)皮一氧化氮合酶基因的T

11、-786C多態(tài)進(jìn)行基因分型。通過(guò)尿中F2-異前列烷排泄物來(lái)評(píng)估吸煙者的氧化應(yīng)激。 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)論：內(nèi)皮一氧化氮合酶基因可改變吸煙的動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人的腦循環(huán)，使腦血流速度增高。 第三部分、結(jié)合珠蛋白遺傳多態(tài)性與動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)性探討。 目的：探討動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血中結(jié)合珠蛋白（Hp）表型和Hp基因頻率的分布及其與病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。

12、 方法：分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組病人197例，其中98例ASAH發(fā)生腦血管痙攣及99例未發(fā)生腦血管痙攣，即又分為未痙攣組和痙攣組，年齡28～79歲，平均年齡（39.9±14.8）歲，已排除有明顯高血壓、糖尿病、心臟病的病人；對(duì)照組195例正常人，年齡27～79歲，平均年齡（38±15.3）歲，無(wú)高血壓、糖尿病、心腦血管病。其中痙攣組根據(jù)腦血管痙攣的程度分三分級(jí)。同時(shí)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)檢測(cè)197例SAH病人和1

13、95例正常對(duì)照者血中Hp表型的分布。 結(jié)論：血清有Hp2-1和Hp2-2的人群可能對(duì)腦血管痙攣有遺傳易感性。Hp2基因在未痙攣組和痙攣組病人中有聚集現(xiàn)象，與其遺傳易感性增高有某種內(nèi)在聯(lián)系，可能在CVS發(fā)病及發(fā)展中起一定作用。 第四部分、載脂蛋白E基因多態(tài)性與動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)性研究。 目的：探討載脂蛋白E（APOE）基因多態(tài)與動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（ASAH）及腦血管痙攣（CVS）間的相關(guān)程度。

14、 方法： 1.研究對(duì)象及分類評(píng)估：實(shí)驗(yàn)組SAH病人，共197例，98例發(fā)生腦血管痙攣（CVS）及99例未發(fā)生腦血管痙攣，年齡28～79歲，平均年齡（39.9±14.8）歲，已排除有明顯高血壓、糖尿病、心臟病的病人；正常對(duì)照組195例，年齡27～79歲，平均年齡（38±15.3）歲，無(wú)高血壓、糖尿病、心腦血管病。所有病人在入院時(shí)進(jìn)行頭顱CT掃描并根據(jù)Fisher分級(jí)、Hunt and Hess分級(jí)及世界神經(jīng)外科醫(yī)師聯(lián)盟（WFNS）

15、臨床分級(jí)評(píng)分進(jìn)行分類；術(shù)后6個(gè)月參照格拉斯哥預(yù)后評(píng)分（GOS）判斷預(yù)后。 2.標(biāo)本采集：所有入選病人禁食12 h后，抽清晨空腹血5 ml，其中2 ml血（EDTA抗凝）常規(guī)提取DNA進(jìn)行APOE基因多態(tài)性分析；3ml血測(cè)定血脂、血糖等生化指標(biāo)。 3.血脂和載脂蛋白測(cè)定：血標(biāo)本采集后，在同一臺(tái)全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、載脂蛋白A（ApoA

16、）與載脂蛋白B（ApoB）測(cè)定。 4.基因組DNA提取：提取外周血基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，引物上游序列為：5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’，引物下游序列為：5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3'。 5.PCR擴(kuò)增及Cfol內(nèi)切酶消化：PCR擴(kuò)增在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，其中包括基因組DNA 200 ng，引物10pmol/L，4×dNTP各100μmo

17、l/L，氯化鎂2.5 mol/L，二甲基亞砜10% （V/V），TaqDNA聚合酶1U，并加入1滴礦物油覆蓋反應(yīng)物。然后進(jìn)行95℃35 s變性，60℃35 s退火，70℃60 s延伸，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。限制性酶切反應(yīng)也在20μl體系中進(jìn)行，其中包括PCR反應(yīng)產(chǎn)物12μl，Cfol內(nèi)切酶8U （10 U／μl），輕輕混勻后置于37℃消化過(guò)夜，消化產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。 6.銀染：電泳后凝膠用蒸餾水沖