東方粘蟲細(xì)胞原代培養(yǎng)及幾種天然活性物質(zhì)的細(xì)胞毒性測(cè)定.pdf

1、以東方粘蟲不同蟲態(tài)為材料，原代培養(yǎng)了血淋巴細(xì)胞、脂肪體細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、中腸細(xì)胞。以培養(yǎng)的東方粘蟲中腸細(xì)胞和棉鈴蟲卵巢細(xì)胞為供試細(xì)胞測(cè)試了苦皮藤素V、白鮮堿、梣皮酮和一系列苦皮藤素衍生物的細(xì)胞毒性。結(jié)果如下： 1.細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)M199培養(yǎng)基較TNM-FH培養(yǎng)基和Grace's培養(yǎng)基適合血淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。接種半小時(shí)的血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基呈黑色，多次更換培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基顏色趨于正常，一個(gè)月后細(xì)胞開始生長(zhǎng)，三個(gè)月后細(xì)

2、胞出現(xiàn)克隆堆。 對(duì)來自東方粘蟲蛹的脂肪體細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)，得到了圓形和梭形兩種細(xì)胞。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)M199培養(yǎng)基不利其生長(zhǎng)，而在Grace's培養(yǎng)基和TNM-FH兩種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，圓形細(xì)胞呈卵粒狀排列生長(zhǎng)，有接觸抑制現(xiàn)象。梭形細(xì)胞較圓形細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢且貼壁較緊，不利其傳代培養(yǎng)。 對(duì)中腸細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)TNM-FH培養(yǎng)基較Grace's培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基利于中腸細(xì)胞生長(zhǎng)。中腸細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈疏松狀貼壁生長(zhǎng)，一個(gè)月后細(xì)胞成活

3、率變得穩(wěn)定，半年后，部分圓形細(xì)胞以其自身為中心分化出梭形細(xì)胞，梭形細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，每生長(zhǎng)一代大約需要三個(gè)月。 對(duì)來自卵的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)TNM-FH培養(yǎng)基較適合胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞圓形，貼壁生長(zhǎng)，圓形細(xì)胞在一個(gè)月左右生長(zhǎng)形成網(wǎng)狀纖維束。經(jīng)過兩個(gè)多月的培養(yǎng)，纖維束周圍有大量圓形細(xì)胞生長(zhǎng)。六個(gè)月后，部分圓形細(xì)胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象，分化出梭形細(xì)胞，但該梭形細(xì)胞較脂肪體細(xì)胞和中腸細(xì)胞分化的梭形細(xì)胞大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在梭形細(xì)胞的周圍可以看到一

4、些小的圓形細(xì)胞。 2.細(xì)胞毒性測(cè)定采用MTT比色法、中性紅攝取法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定了天然活性物質(zhì)苦皮藤素V、白鮮堿和梣皮酮對(duì)東方粘蟲中腸細(xì)胞的毒性。在MTT比色法中，確立了甲臜結(jié)晶裂解液酸化異丙醇溶液的測(cè)試波長(zhǎng)為558 nm，10％SDS裂解液的測(cè)試波長(zhǎng)為568 nm，二甲亞砜的測(cè)試波長(zhǎng)為497 nm。在本實(shí)驗(yàn)中用二甲亞砜做為甲躦結(jié)晶裂解液，選用492nm做為酶標(biāo)儀的測(cè)試波長(zhǎng)。MTT比色法、中性紅攝取法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)得的苦皮藤

5、素V對(duì)粘蟲中腸細(xì)胞的LC<,50>分別為9.08、7.79和10.94.mg·L<'-1>；白鮮堿為27.85、31.77和36.42 mg·L<'-1>；梣皮酮為186.66、164.00和189.43 mg·L<'-1>；3種化合物相對(duì)而言，苦皮藤素V對(duì)中腸細(xì)胞毒性最強(qiáng)，白鮮堿次之，而梣皮酮較差。 采用MTT比色法測(cè)定了15個(gè)苦皮藤素衍生物對(duì)棉鈴蟲卵巢細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明： 在這15個(gè)衍生物中，有6個(gè)衍生物的LC<,