T-bet和c-FLIP雙基因共表達質(zhì)粒的構(gòu)建及生物學活性檢測.pdf

1、腫瘤組織通過分泌的抑制性細胞因子可抑制機體的細胞免疫應(yīng)答；腫瘤細胞又可通過高表達Fas-L，誘導Fas-L陽性的腫瘤浸潤淋巴細胞凋亡，這兩者都被認為與腫瘤逃避機體的免疫監(jiān)視密切相關(guān)，而糾正此種免疫逃逸則是腫瘤免疫治療的重要機制和思路。T-bet是調(diào)節(jié)Th1型細胞免疫的關(guān)鍵因子：c-FLIPs能夠抑制腫瘤細胞引起的凋亡信號的傳遞。兩者的聯(lián)合應(yīng)用，一是提高Th1細胞數(shù)量，將有利于腫瘤患者失衡的Th1/Th2比例的恢復；同時，減少或避免活化的

2、CTL的凋亡，均有利于細胞免疫功能的增強，有利于促進抗腫瘤免疫，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。本課題的研究思路和立題依據(jù)就是通過轉(zhuǎn)T細胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet基因調(diào)整Th1/Th2比例失衡，運用轉(zhuǎn)入c-FLIP基因調(diào)控CTL的細胞凋亡，探討c-FLIP基因?qū)TL細胞凋亡的調(diào)控作用及對其抗瘤效應(yīng)的影響，以期進一步闡明CTL細胞凋亡及抗凋亡的機制，為惡性腫瘤的過繼免疫治療提供更高效、特異的免疫活性細胞，為腫瘤的防治提供新的手段和方案。 第

3、一部分人Th1細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet基因表達載體的構(gòu)建免疫偏移(Th1/Th2)在腫瘤細胞免疫耐受中起著重要作用。因此，提高Th1細胞數(shù)量，將有利于腫瘤患者失衡的Th1/Th2比例的恢復，有利于細胞免疫功能的增強，有利于促進抗腫瘤免疫，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。T-bet(T box expressed in T cells，T-bet)作為Th1特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在Th1細胞的分化中起著決定性的作用。因此，有望通過構(gòu)建表達T-bet

4、基因的真核表達載體，調(diào)控Th1細胞分化，有利于糾正腫瘤患者的免疫偏移。目的：構(gòu)建表達T-bet基因的真核載體。 方法：采用RT-PCR方法從人外周血淋巴細胞中擴增T-bet cDNA序列并測序；利用載體pEGFP-C1，構(gòu)建重組真核表達載體pEGFP-C1．T-bet及檢測。 結(jié)果：從淋巴細胞中提取的RNA質(zhì)量較好，經(jīng)RT-PCR擴增出目的基因T-bet大小為1608bp并測序證實。 結(jié)論：成功構(gòu)建表達T-bet

5、基因的真核表達載體。 第二部分腺病毒介導c-FIriPs基因誘導淋巴細胞抗凋亡作用許多腫瘤細胞高表達Fas-L，誘導Fas<'+>的腫瘤浸潤淋巴細胞調(diào)亡，以躲避機體的免疫攻擊。c-FLIP能抑制Fas介導的細胞凋亡。本實驗采用腺病毒pAdeasy系統(tǒng)構(gòu)建含有c-FLIPs基因的重組腺病毒，觀察其體外誘導T淋巴細胞產(chǎn)生抗凋亡作用。 方法：采用RT-PCR的方法，從人T淋巴細胞株的總RNA中克隆c-FLIPs基因；通過pAd

6、easy系統(tǒng)，構(gòu)建表達c-FLIPs的重組腺病毒Ad．c-FLIPS；Hochest染色法及FCM法檢測anti-Apo-1誘導感染Ad．c-FLIPs后的H9細胞凋亡。 結(jié)果：采用RT-PCR方法從人T淋巴細胞株中擴增出c-FLIPS基因；構(gòu)建重組腺病毒Ad.c-FL,IPs；經(jīng)Hoechst染色，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)DNA的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)anti-Apo-1誘導凋亡處理24h后，未經(jīng)Ad.c-FLIPs感染的H9細胞有

7、大量的細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細胞；Ad.c-FLIPs感染的H9細胞中細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細胞數(shù)明顯減少，大部分細胞染色質(zhì)呈彌漫均勻低強度熒光；流式細胞儀分析經(jīng)PI染色后的H9細胞，未經(jīng)Ad.c-FLIPs預處理的H9細胞在anti-Apo-1作用24h后，細胞的凋亡率分別為48.33％±7.41％；經(jīng)Ad.c-FLIPs預處理1d的H9細胞，其細胞凋亡率分別下降到3.6％±0.21％。結(jié)論：重

8、組腺病毒Ad.c-FLIPs有效地誘導淋巴細胞的抗凋亡作用。 第三部分 T-bet和c-FLIP雙基因共表達質(zhì)粒構(gòu)建及生物學活性檢測研究顯示腫瘤組織多分泌Th2類細胞因子，Th2類細胞因子優(yōu)勢狀態(tài)是腫瘤免疫的機理之一。因此，促使荷瘤內(nèi)Th2向Th1逆轉(zhuǎn)，重新達到平衡，成為腫瘤免疫治療的新思路。Fas屬于細胞凋亡信號受體，與其配體FasL結(jié)合后誘導Fas所在細胞的凋亡。腫瘤通過Fas系統(tǒng)逃避機體的免疫攻擊，因此如何抑制腫瘤的Fas

9、反擊，并利用Fas系統(tǒng)促進腫瘤細胞的凋亡在腫瘤的免疫治療中具有重要意義。T-bet是一個重要的Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)節(jié)Th1型細胞分化的關(guān)鍵因子；c-FLIP能夠抑制Fas誘導的細胞凋亡信號傳遞，因此，構(gòu)建T-bet及c-FLIP基因共表達的真核載體，有望在誘導Th1細胞向Th1型細胞分化的同時，產(chǎn)生抗腫瘤誘導的免疫細胞凋亡作用。 目的：構(gòu)建攜帶T-bet和c-FLIP雙基因的真核表達載體及檢測其生物學活性。方法：采用RT-

10、PCR方法從人外周血淋巴細胞的總RNA中擴增出T-bet和c-FLIP cDNA，利用pIRES和pEGFP-C1，構(gòu)建T-bet和c-FLIP雙基因真核表達載體pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP。采用非脂質(zhì)體的脂質(zhì)型介導載體將pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP轉(zhuǎn)染至外周血淋巴細胞，觀察T-bet和c-FLIP在外周血淋巴細胞中的表達，并檢測其誘導淋巴細胞的抗凋亡作用及Th1/Th2細胞偏移。 結(jié)果：成功構(gòu)建

11、pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP質(zhì)粒，運用非脂質(zhì)體的脂質(zhì)型介導載體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染淋巴細胞，其轉(zhuǎn)染率為34.6％。流式細胞儀分析未經(jīng)pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP預處理的淋巴細胞在CH-11作用24h后，細胞的凋亡率分別為(50.12％±8.02％)：經(jīng)pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP預處理1d的淋巴細胞，其細胞凋亡率分別下降到(5.73％±0.37％)；雙基因表達的淋巴細胞的Th1型細胞因子IFN-γ