miR-193b在胰腺癌中表達及功能的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　胰腺癌(PC)是最致命的惡性腫瘤之一，居全世界癌癥相關(guān)死亡原因第8位。胰腺癌預后差的主要原因是早期缺乏特異性臨床癥狀、無有效的早期診斷標志物、早期轉(zhuǎn)移及對標準的放化療效果差。胰腺癌發(fā)生機制復雜，目前尚不十分明確，尋找新的診斷治療靶點是胰腺癌研究的重點。
　　microRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNA，長度為19-24nt，它能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達或翻譯，廣泛地參與細胞增殖、分化

2、、凋亡和代謝等重要的生物學過程。大量文獻表明microRNA可作為癌基因或者抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此深入研究miRNA在人體腫瘤中的表達及其功能，對探索腫瘤的發(fā)病機制具有重要意義，并將有利于對腫瘤的診斷、治療及預后的判斷。miR-193b由位于16p13.12上的基因所編碼，目前已有不少研究報道m(xù)iR-193b在多種人類惡性腫瘤中的表達失調(diào)并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如宮頸腫瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、急性淋巴細胞白血病等，提

3、示miR-193b可能在人類惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。Ikeda Y等研究發(fā)現(xiàn)miR-193b是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關(guān)miRNA，外源性過表達miR-193b能抑制培養(yǎng)胰腺癌細胞的增殖，表明miR-193b可能參與了PC發(fā)生發(fā)展并扮演著重要作用。然而，目前關(guān)于miR-193b在人胰腺癌組織中的表達及生物學作用機制尚不明確。
　　目的:
　　檢測人胰腺癌組織及胰腺癌細胞系中miR-193b和STMN1的表

4、達的情況，分析二者在胰腺癌組織中表達的相關(guān)性和STMN1蛋白表達與胰腺癌患者臨床病理因素及根治性胰腺癌術(shù)后患者預后之間的關(guān)系;探討miR-193b和STMN1(癌蛋白18)在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能機制并驗證miR-193b對STMN1的靶向調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1.收集新鮮胰腺癌組織及與其配對的癌旁組織、胰腺癌細胞系并收集胰腺癌石蠟切片及正常胰腺組織。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測m

5、iR-193b、STMN1 mRNA在胰腺癌組織和細胞系中表達，分析兩者在胰腺癌組織中表達相關(guān)性;Western blot檢測STMN1蛋白在人胰腺癌組織和細胞系中表達;免疫組化檢測STMN1蛋白在胰腺癌中表達情況，分析STMN1蛋白表達與胰腺癌臨床病理因素及根治性胰腺癌術(shù)后患者預后之間的關(guān)系。
　　2.將hsa-miR-193b mimic使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染入Panc-1細胞，同時設置陰性對照組和空

6、白對照組。Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染hsa-miR-193b mimic后Panc-1細胞中miR-193b表達情況。分別運用MTT法、流式細胞術(shù)和Transwell法檢測表達上調(diào)miR-193b后對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。用western blot方法檢測上調(diào)miR-193b后STMN1蛋白表達水平。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSTMN1是miR-193b的下游直接靶基因。
　　3.購買針對STMN1的特異性si

7、RNA，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，同時設立陰性對照組和空白對照組。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot檢測STMN1-siRNA對STMN1表達的影響;分別運用MTT法、流式細胞術(shù)和Transwell法檢測沉默STMN1表達后對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。Western blot檢測轉(zhuǎn)染STMN1-siRNA后Panc-1細胞中α微管蛋白及乙酰化α微

8、管蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.miR-193b在人胰腺癌組織中表達明顯低于癌旁胰腺組織及正常胰腺組織，miR-193b在TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期的胰腺癌組織中表達較Ⅰ期和Ⅱ期的胰腺癌組織中表達明顯低。同時miR-193b在人胰腺癌細胞系中表達較正常胰腺組織明顯低。
　　2.生物信息學軟件預測STMN1為miR-193b潛在下游直接靶基因。
　　3.STMN1 mRNA和蛋白在胰腺癌組織中表達明顯高于癌旁組織;

9、STMN1 mRNA和蛋白在胰腺癌細胞系中表達明顯高于正常胰腺組織。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示STMN1蛋白在胰腺癌中高表達，主要表達在細胞漿中，而在正常胰腺組織中主要為陰性表達;STMN1蛋白表達水平與胰腺癌的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān);STMN1蛋白陽性表達組根治性胰腺導管腺癌患者的生存率明顯低于陰性表達組;單、多因素分析顯示STMN1是根治性胰腺癌術(shù)后患者預后的獨立危險因素。
　　5.人胰腺癌組織中miR-1

10、93b和STMN1 mRNA表達呈明顯負相關(guān)。
　　6.通過轉(zhuǎn)染miR-193b mimic成功上調(diào)了Panc-1細胞內(nèi)miR-193b表達水平，miR-193b能明顯下調(diào)STMN1蛋白的表達，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實STMN1是miR-193b下游直接靶基因。
　　7.上調(diào)Panc-1細胞內(nèi)miR-193b表達可抑制細胞增殖、抑制細胞遷移和侵襲并促進細胞凋亡。
　　8.通過轉(zhuǎn)染STMN1-siRNA沉默Panc-1

11、細胞中STMN1表達，Real-time PCR和Western blot顯示STMN1-siRNA可抑制STMN1表達，沉默Panc-1細胞內(nèi)STMN1表達可抑制細胞增殖、抑制細胞遷移和侵襲并促進細胞凋亡;沉默STMN1表達上調(diào)了Panc-1細胞中乙?；廖⒐艿鞍椎谋磉_水平。
　　結(jié)論:
　　1.miR-193b在胰腺癌組織及細胞系中均低表達。
　　2.STMN1在胰腺癌組織及細胞系中均高表達，STMN1蛋白表達與病

12、理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及根治性胰腺癌術(shù)后患者差的預后明顯相關(guān)，STMN1是根治性胰腺癌術(shù)后患者獨立危險因素。
　　3.胰腺癌組織中miR-193b與STMN1 mRNA表達呈明顯負相關(guān)。
　　4.miR-193b能直接靶向下調(diào)STMN1蛋白表達并抑制Panc-1細胞增殖、遷移和侵襲，同時促進細胞凋亡。
　　5.STMN1能下調(diào)Panc-1細胞中α-微管蛋白乙?；?，促進微管解聚，同時促進Panc-1細胞增殖、