RNA干擾樹突狀細胞對狼瘡腎炎小鼠的治療研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一累及全身多系統(tǒng)，多器官的自身免疫性性疾病，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE最常見的臨床表現(xiàn)之一，是一種免疫復合物介導的腎小球疾病。狼瘡性腎炎的治療近年已取得了很大進展，糖皮質激素和/或免疫抑制劑及細胞毒性藥物仍是LN治療的首選藥物。然而還有很多問題沒有解決，終末期腎功能衰竭仍是LN死亡的主要原因之一。另外糖皮質激素和免疫抑制劑及細胞毒性藥物的長期應用引起的毒副作用尚有待解決。因此有必

2、要尋求一種新的治療途徑。
　　 大量的研究表明在SLE患者體內無論是B細胞異常引起的體液免疫反應還是T細胞異常引起的細胞免疫反應都與樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的功能改變有直接關系。
　　 DC是一種已知功能最強的專職抗原提呈細胞，研究表明DC是免疫調節(jié)網(wǎng)絡的核心細胞，除了具有免疫激發(fā)功能外，在誘導中樞免疫耐受以及外周免疫耐受的維持和調節(jié)也發(fā)揮重要作用。研究認為DC的來源、表型、成熟度和功能的異質性是

3、平衡免疫反應和免疫耐受的重要因素。
　　 輔助性T細胞(Th)可分為Th1和Th2細胞，生理條件下，機體的Th1細胞和Th2細胞處于相對平衡狀態(tài)，一旦這種平衡發(fā)生平衡發(fā)生偏離，機體就會處于疾病狀態(tài)。最近的研究表明，Th1/Th2細胞的平衡偏離及細胞因子調節(jié)網(wǎng)絡異常與SLE的發(fā)病及病理損傷密切相關。研究認為輔助性T細胞的分化主要受DC所調控。DC通過其表面分子刺激T細胞活化，通過細胞因子調節(jié)Th細胞分化方向。通過調控DC的成熟，進

4、而調節(jié)Th1/Th2細胞分化過程和影響它們的效應機制是誘導免疫應答和免疫耐受的關鍵。
　　 核轉錄因子(NF-κB)是已知的在炎癥和免疫中發(fā)揮核心作用的轉錄因子，被認為是DC發(fā)育成熟的關鍵性調控基因，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有五種NF-κB/REL成員。人類嘗試利用RNAi技術減弱NF-κB表達及活性，以期獲得致耐受DC。RelB作為NF-KB家族的五個成員之一，是小鼠骨髓DC發(fā)育成熟所必需的，因而RelB不失為RNAi作用的一個很好靶

5、標。本實驗擬采用利用RNA干擾抑制RELB基因表達來構建耐受性DC應用于治療狼瘡腎炎小鼠。
　　 目的：
　　 1.RNA干擾樹突狀細胞成熟的免疫耐受作用及機制。
　　 2.觀察RNA干擾樹突狀細胞成熟對狼瘡腎炎小鼠的治療效應，為LN治療提供新的思路與依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC細胞，于收集前24小時加入LPS(1ug/ml)可得到成熟DC即mDC.收集mDC用Lip

6、ofectamine2000介導RNA干擾，實驗分為5組：第1組RNAi的陽性對照；第2組RNAi的陰性對照；第3、4、5組分別加入siRNA序列1、siRNA序列2、siRNA序列3。通過半定量RT-PCR檢測各組細胞中relB的mRNA含量，Western Blot檢測relB蛋白含量。篩選出阻斷relB效果最明顯的siRNA序列，然后轉入體外培養(yǎng)的mDC。與未轉染組做對照。光鏡電鏡檢測DC形態(tài)檢測;流式細胞檢測DC表面標志(MHC

7、Ⅱ、CD80、CD86)；ELISA檢測DC分泌細胞因子(IL-12)的改變。
　　 同時制造狼瘡腎炎模型.通過檢測血清抗ds-DNA抗體，尿蛋白檢測，腎組織光電鏡觀察進行鑒定.
　　 將干擾后的樹突狀細胞輸入狼瘡腎炎動物模型中，模型鼠分為3組：空白對照組(尾靜脈注射生理鹽水)，非干預組(尾靜脈注射未處理DC)，干預組(尾靜脈注射干擾后DC).檢測各組蛋白尿水平、血清抗ds-DNA抗體及腎組織病理改變。
　　 結

8、果:
　　 小鼠骨髓細胞在rmGM-CSF和rmIL-4刺激下培養(yǎng)，隨培養(yǎng)時間延長，細胞集落明顯增多，到5-7天，可見大量細胞懸浮.經(jīng)流式檢測CD11c陽性率比較高.3個序列siRNA干擾mDC后其中有序列3 siRNA能明顯沉默RelB基因。特異位點的RelB siRNA干擾后DC形態(tài)近似未成熟DC，MHCⅡ、CD80，CD86水平及細胞因子(IL-12)的分泌顯著低于未干擾組.
　　 模型鼠自第4周開始出現(xiàn)尿蛋白升高

9、，抗ds-DNA抗體陽性，腎臟病理表現(xiàn)為腎小球彌漫增生，炎癥細胞增多。
　　 siRNA干擾后的耐受性DC輸入模型鼠體內后3周尿蛋白排泄減少，抗ds-DNA抗體水平下降，腎臟病理改變減輕。
　　 結論:
　　 1.特異位點的RelB siRNA對小鼠骨髓來源DC有抑制成熟作用：
　　 (1)siRNA干擾后DC形態(tài)近似未成熟DC，樹突減少；
　　 (2)降低細胞表面MHCⅡ、CD80、CD86水平

10、；
　　 (3)抑制DC分泌IL-12。
　　 2.淋巴細胞輸入能誘導小鼠狼瘡腎炎樣模型：
　　 (1)模型鼠表現(xiàn)為類似狼瘡腎炎樣癥狀如脫毛，腹水，消瘦;
　　 (2)模型鼠尿蛋白水平顯著增高；
　　 (3)抗ds-DNA抗體陽性；
　　 (4)腎臟病理表現(xiàn)為腎小球彌漫增生，炎癥細胞侵潤。
　　 3.siRNA干擾后的耐受性DC對模型鼠有一定的治療作用：
　　 (1)耐受性