RNA干擾RelB慢病毒載體的構(gòu)建及其誘導(dǎo)骨髓致耐受樹(shù)突狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 胸腺抗原特異性T細(xì)胞耐受的誘導(dǎo)和在外周的維持是預(yù)防自身免疫病的關(guān)鍵。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)作為一種專(zhuān)職的抗原提呈細(xì)胞，除了刺激作用外，許多證據(jù)表明其在維持和調(diào)節(jié)T細(xì)胞外周免疫耐受方面也具有重要作用。這種控制功能是由某種成熟階段和不同來(lái)源亞型來(lái)決定，并受到某種免疫調(diào)節(jié)劑的影響。DC誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受或T細(xì)胞活化取決于DC的成熟狀態(tài)。在缺乏病原入侵或無(wú)炎癥的穩(wěn)定狀態(tài)下，DC是以不成熟的形式

2、存在。未成熟DC傾向于誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生，成熟DC則傾向于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。骨髓來(lái)源的DC傾向于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，淋巴來(lái)源的DC則傾向于誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生。近年來(lái)人們利用未成熟狀態(tài)的DC具有誘導(dǎo)免疫耐受的能力，采用基因修飾、抗體技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)以及體外培養(yǎng)等方法維持DC的未成熟狀態(tài)，制備致耐受DC，在實(shí)體器官移植和自身免疫病的防治中起到了舉足輕重的作用。IL-4基因修飾小鼠骨髓DC可顯著減少小鼠的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病。IL-10基因修飾的

3、骨髓DC可顯著延長(zhǎng)同種心臟移植物的存活。用RNAi技術(shù)干擾DC的IL-12水平，可產(chǎn)生具有致T細(xì)胞免疫耐受的DC，即致耐受DC。 盡管DC在免疫介導(dǎo)的疾病中起重要作用，但機(jī)體內(nèi)DC的含量甚微，在外周血單個(gè)核細(xì)胞中不到1％，為痕量細(xì)胞群體。20世紀(jì)90年代DC體外大規(guī)模擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展為DC的研究帶來(lái)了前所未有的機(jī)遇。在低劑量的GM-CSF和IL-4的聯(lián)合作用下可誘導(dǎo)骨髓前體細(xì)胞產(chǎn)生大量的DC。在DC體外大規(guī)模擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用

4、最近發(fā)展的RNAi技術(shù)(RNAinterference，RNAi)針對(duì)影響DC發(fā)育成熟的關(guān)鍵基因NF-k B/RelB進(jìn)行干預(yù)，篩選出干擾效率最高的shRNA，包裝成慢病毒，感染骨髓DC(Bone marrow derived DC，BM-DC)，獲得RNAiRelB DC，并對(duì)RelB基因沉默的BM-DC進(jìn)行形態(tài)學(xué)、表型和免疫功能的鑒定，以期構(gòu)建出RelB基因沉默的新型致耐受DC，即RNAi RelB DC，研究其在T細(xì)胞免疫耐受誘導(dǎo)

5、中的可能機(jī)制，為成功應(yīng)用這種新型DC治療移植排斥反應(yīng)及自身免疫病提供一定的理論依據(jù)。 方法： 1、小鼠骨髓DC的體外培養(yǎng)和鑒定： 無(wú)菌分離C57BL/6小鼠骨髓前體細(xì)胞，在低劑量的重組小鼠粒細(xì)胞．巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)作用下，經(jīng)輕柔手法篩選并結(jié)合CDllc+免疫磁珠分選方法，培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓來(lái)源DC(BM-DC)，并利用脂多糖(LPS)于細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前24h刺

6、激誘導(dǎo)DC成熟。實(shí)驗(yàn)分兩組：①對(duì)照組DC(Control-DC)：經(jīng)手法篩選后免疫磁珠分選體外培養(yǎng)第6天的DC，即未成熟DC；②脂多糖刺激DC組(LPS-DC)：在培養(yǎng)結(jié)束前24h終濃度為1μg/mL的LPS刺激DC，即成熟DC組。并在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)和同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(allogenic mixed lymphic reaction)免疫功能以及RelB基因表達(dá)水平等方面進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。 2、RNA干擾RelB基

7、因慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定： 根據(jù)不同成熟狀態(tài)的骨髓DC表達(dá)RelB基因水平的不同，我們利用https：//maidesigner.invitrogen.com/maiexpress/在線軟件設(shè)計(jì)2個(gè)位點(diǎn)的RelB干擾序列。采用U6慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建目標(biāo)基因RelB的慢病毒shRNA表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，在293FT細(xì)胞中包裝病毒粒子，病毒包括3種，目標(biāo)基因RelB的R2和R5以及陰性對(duì)照T6。分別對(duì)這3個(gè)病毒粒子進(jìn)行滴度測(cè)定

8、。采用體外培養(yǎng)第4天的骨髓來(lái)源的未成熟DC進(jìn)行感染，利用RT-PCR和免疫熒光染色方法進(jìn)行各感染組的RelB表達(dá)水平檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置未成熟DC對(duì)照組。 3、骨髓致耐受樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)及免疫功能研究： 在有效沉默BM-DC表達(dá)RelB的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討RelB沉默的BM-DC的生物免疫學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：①未成熟：DC對(duì)照組；②LPS刺激成熟DC對(duì)照組；③RelB沉默的BM-DC組；④LPS刺激RelB沉默的BM-DC組。

9、分別對(duì)這4組DC的形態(tài)、表面分子表達(dá)和細(xì)胞免疫功能(IL-12分泌水平、Th1/Th2細(xì)胞因子分泌、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等)方面探討RelB沉默的BM-DC的生物免疫學(xué)功能。 結(jié)果： 1、在低劑量的rmGM-CSF和rm-IL-4的誘導(dǎo)下，成功地誘導(dǎo)出大量的骨髓DC，每2只小鼠獲得BM-DC約1～2×10<'7>，基本上可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要。手法篩選的BM-DC的CDllc陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)70％，結(jié)合免疫磁珠分選后CDllc陽(yáng)性細(xì)胞的可

10、獲得90％以上純度的BM-DC。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，對(duì)照組DC(Control DC)低水平表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子、CD86和CD40，符合未成熟DC的特點(diǎn)，視為未成熟DC組；脂多糖刺激DC組(LPS-DC)高水平表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子、CD86和CD40，符合成熟DC的特點(diǎn)，視為成熟DC組。對(duì)上述2組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也顯示Control DC細(xì)胞形態(tài)多為圓形，表面多褶皺，突起較少，細(xì)胞器較少，但細(xì)胞內(nèi)含有較多的吞飲泡樣結(jié)構(gòu)；而LPS-DC細(xì)

11、胞內(nèi)囊泡樣結(jié)構(gòu)較少，細(xì)胞內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富，細(xì)胞質(zhì)回縮，突起明顯。對(duì)DC分泌IL-12的水平的ELISA結(jié)果顯示，Control DC的IL-12分泌水平顯著低于LPS-DC(P<0.01)。刺激同種異基因T細(xì)胞增殖(MLR)(P<0.01)以及RelB基因表達(dá)水平的研究也得到了類(lèi)似的結(jié)果。 2、設(shè)計(jì)合成2個(gè)位點(diǎn)的RelB基因(NM 009046)，行95℃退火處理，經(jīng)4％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到了退火產(chǎn)物dsOli

12、go，將該產(chǎn)物與pENTR<'TM>/U6連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性(50μg/mL)平板篩選陽(yáng)性克隆，U6前引物(5′-GGACTATCATATGCTTACCG-3′)測(cè)序結(jié)果顯示獲得了陽(yáng)性克隆。將目標(biāo)基因陽(yáng)性克隆質(zhì)粒與慢病毒載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化Stb13感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素(Amp)抗性篩選后，進(jìn)行30μg/mL氯霉素的LB平板中的藥物負(fù)篩選，U6前引物測(cè)序再次表明2個(gè)位點(diǎn)的重組子均為陽(yáng)性重組子。將陽(yáng)性重組子與Vi

13、raPower<'TM>包裝質(zhì)?；旌衔镌谫|(zhì)脂體Lipofectamine<'TM> 2000的介導(dǎo)下，在293FT細(xì)胞中包裝病毒，收獲含病毒的上清液，-80℃保存。利用系列稀釋法(10<'-2>～10<'-6>)測(cè)定慢病毒貯液滴度，進(jìn)行殺稻瘟菌素(濃度為10μg/mL)的藥物篩選，感染的細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆，在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，測(cè)定病毒的滴度為6×10<'5>TU/mL(Transducing Unit(TU)/mL)。將2個(gè)位點(diǎn)的

14、慢病毒和1個(gè)陰性對(duì)照對(duì)骨髓未成熟DC進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)。流式表型分析各實(shí)驗(yàn)組DC表面分子表達(dá)水平，顯示R5位點(diǎn)表面CD40分子表達(dá)最低，RT-PCR顯示其中R5位點(diǎn)RelB基因表達(dá)較低；細(xì)胞免疫熒光分析結(jié)果也顯示R5位點(diǎn)RelB蛋白表達(dá)水平也較低，也即R5位點(diǎn)干擾效果最好。 3、用R5位點(diǎn)慢病毒感染未成熟BM-DC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓性，細(xì)胞內(nèi)有大量囊泡結(jié)構(gòu)，部分囊泡可見(jiàn)吞噬的異物，細(xì)胞核多偏向一側(cè)，溶酶體和線粒體等細(xì)胞器少

15、，表面突起少，形態(tài)較規(guī)則。細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子、CD40、CD86等表面分子較低，MLR顯示較弱的刺激T細(xì)胞增殖能力。IL-12的ELISA結(jié)果顯示細(xì)胞低水平分泌IL-12，MLR反應(yīng)中誘導(dǎo)ThO向Th2細(xì)胞偏倚，IL-2和IFN-γ分泌抑制，IL-10和IL-4分泌相對(duì)占優(yōu)勢(shì)。 結(jié)論： l、在低劑量的rmGM-CSF和rmlL-4誘導(dǎo)下，從小鼠骨髓前體細(xì)胞中可擴(kuò)增得到大量的BM-DC。經(jīng)小鼠CDllc<'+>免疫磁

16、珠陽(yáng)性分選，可獲得純度高達(dá)90％以上的高純度BM-DC。對(duì)成熟BM-DC和未成熟BM-DC進(jìn)行免疫學(xué)功能及RelB基因表達(dá)水平的比較顯示未成熟BM-DC傾向于誘導(dǎo)免疫耐受且低水平表達(dá)RelB基因，而成熟BM-DC傾向于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答且高水平表達(dá)RelB基因，RelB基因表達(dá)水平與：DC的成熟狀態(tài)有關(guān)。 2、成功地構(gòu)建了小鼠RelB基因RNAi慢病毒載體，克隆出R2和R5兩個(gè)位點(diǎn)的干擾載體，并進(jìn)行慢病毒的包裝和滴度測(cè)定。 3

17、、成功地獲得了RNAi RelB DC，發(fā)現(xiàn)用R5位點(diǎn)的慢病毒感染未成熟DC，其干擾效果最好，且用該位點(diǎn)的慢病毒感染的DC其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)、細(xì)胞免疫學(xué)功能等均具有與未成熟DC相似的特點(diǎn)，且這種DC不能被LPS刺激成熟，具有致耐受DC特性，有望進(jìn)一步應(yīng)用于移植排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病的防治。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1、首次利用慢病毒載體的方法對(duì)DC進(jìn)行RelB基因的RNAi實(shí)驗(yàn)，并探討其應(yīng)用于自身免疫性疾病生物治療的可