穩(wěn)定轉染Dicer基因對HELF細胞功能的影響.pdf

1、目的：表觀遺傳學是研究基因組DNA序列不發(fā)生變化而發(fā)生的基因表達的可遺傳改變的學科。目前，表觀遺傳學研究主要包括：DNA甲基化、組蛋白密碼和染色質重塑、非編碼RNA調控，在他們相互作用的系統(tǒng)中某一環(huán)節(jié)的異常就可以導致基因的不正常表達，從而導致包括腫瘤在內的與表觀遺傳學相關的疾病。腫瘤的發(fā)生是由于細胞出現(xiàn)異常增殖，在過去，絕大多數(shù)研究都是從編碼蛋白的原癌基因和抑癌基因出發(fā)來進行研究。然而，隨著研究的進展發(fā)現(xiàn)某些腫瘤較少甚至完全沒有基因突變

2、，以及miRNA家族對轉錄后水平極強的調節(jié)能力，讓越來越多的科研人員將重點轉移到miRNA與腫瘤的關系上來。Dicer是miRNA形成過程中必須的酶，所以當Dicer基因表達異常時可能會引起某些miRNA的表達異常從而引起某些癌基因表達增加或抑癌基因表達下降，細胞或組織異常增生，導致腫瘤的發(fā)生。為了進一步研究Dicer基因表達上調在腫瘤發(fā)生中的作用，設計了本實驗，擬通過Dicer基因穩(wěn)定轉染人胚肺細胞(HELF)，制作Dicer基因高表

3、達的細胞模型，通過檢測轉染后HELF細胞增殖能力和遷移能力的變化來分析Dicer基因在腫瘤發(fā)生中所行使的功能。 方法：將pcDNA3.1—Dicer表達質粒應用脂質體介導方法體外穩(wěn)定轉染人胚肺細胞HELF，以轉染空載體pcDNA3.1的HELF細胞作為對照，在轉染48小時后1：7傳代，通過G418篩選細胞克隆，挑取單克隆。應用PCR方法初步篩查HELF細胞中Dicer基因在DNA水平的整合，然后PCR陽性的細胞用RT-PCR方法

4、檢測Dicer基因在RNA水平的表達；根據(jù)RT-PCR結果，分別選擇轉染pcDNA3.1和pcDNA3.1—Dicer細胞各一株進行Western—blot蛋白水平檢測、分析；應用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色實驗(MTT)檢測轉染后細胞增殖能力的改變；應用侵襲力(Transwell)實驗檢測細胞遷移侵襲能力的改變。綜合分析Dicer基因在腫瘤細胞增殖及侵襲轉移過程中的功能。 結果：用脂質體介導的方法將pcDNA3.1—Dicer

5、質粒轉染人胚肺細胞HELF，G418篩選，挑取單克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞用RT-PCR的方法檢測到DicermRNA的轉錄活性明顯增強，進一步用Western方法檢測到Dicer的蛋白表達水平明顯增強，說明轉染成功。與轉染空載體pcDNA3.1的HELF細胞相比，轉染pcDNA3.1—Dicer質粒的HELF細胞24、48、72、96小時的MTT光吸收值顯著升高(P<0.05)；Trans—well方法檢測結果顯示，與轉染空載體pcDNA3.

6、1的HELF細胞相比，轉染pcDNA3.1—Dicer質粒的HELF細胞穿透人工重構基底膜的細胞數(shù)明顯增多，說明轉染pcDNA3.1—Dicer質粒的HELF細胞侵襲能力明顯增強。 結論：pcDNA3.1—Dicer質粒體外穩(wěn)定轉染人胚肺細胞HELF，可以有效地使Dicer基因在RNA水平和蛋白水平表達都增高，并且使HELF細胞MTT光吸收值顯著升高和穿透人工重構基底膜的細胞數(shù)明顯增多，提示Dicer基因高表達可以引起人胚肺細胞