穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dicer基因?qū)ELF細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：表觀遺傳學(xué)是研究基因組DNA序列不發(fā)生變化而發(fā)生的基因表達(dá)的可遺傳改變的學(xué)科。目前，表觀遺傳學(xué)研究主要包括：DNA甲基化、組蛋白密碼和染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控，在他們相互作用的系統(tǒng)中某一環(huán)節(jié)的異常就可以導(dǎo)致基因的不正常表達(dá)，從而導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的疾病。腫瘤的發(fā)生是由于細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，在過(guò)去，絕大多數(shù)研究都是從編碼蛋白的原癌基因和抑癌基因出發(fā)來(lái)進(jìn)行研究。然而，隨著研究的進(jìn)展發(fā)現(xiàn)某些腫瘤較少甚至完全沒(méi)有基因突變

2、，以及miRNA家族對(duì)轉(zhuǎn)錄后水平極強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，讓越來(lái)越多的科研人員將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到miRNA與腫瘤的關(guān)系上來(lái)。Dicer是miRNA形成過(guò)程中必須的酶，所以當(dāng)Dicer基因表達(dá)異常時(shí)可能會(huì)引起某些miRNA的表達(dá)異常從而引起某些癌基因表達(dá)增加或抑癌基因表達(dá)下降，細(xì)胞或組織異常增生，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。為了進(jìn)一步研究Dicer基因表達(dá)上調(diào)在腫瘤發(fā)生中的作用，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，擬通過(guò)Dicer基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚肺細(xì)胞(HELF)，制作Dicer基因高表

3、達(dá)的細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HELF細(xì)胞增殖能力和遷移能力的變化來(lái)分析Dicer基因在腫瘤發(fā)生中所行使的功能。 方法：將pcDNA3.1—Dicer表達(dá)質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚肺細(xì)胞HELF，以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的HELF細(xì)胞作為對(duì)照，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后1：7傳代，通過(guò)G418篩選細(xì)胞克隆，挑取單克隆。應(yīng)用PCR方法初步篩查HELF細(xì)胞中Dicer基因在DNA水平的整合，然后PCR陽(yáng)性的細(xì)胞用RT-PCR方法

4、檢測(cè)Dicer基因在RNA水平的表達(dá)；根據(jù)RT-PCR結(jié)果，分別選擇轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1—Dicer細(xì)胞各一株進(jìn)行Western—blot蛋白水平檢測(cè)、分析；應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的改變；應(yīng)用侵襲力(Transwell)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力的改變。綜合分析Dicer基因在腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的功能。 結(jié)果：用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pcDNA3.1—Dicer

5、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚肺細(xì)胞HELF，G418篩選，挑取單克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞用RT-PCR的方法檢測(cè)到DicermRNA的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步用Western方法檢測(cè)到Dicer的蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的HELF細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1—Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞24、48、72、96小時(shí)的MTT光吸收值顯著升高(P<0.05)；Trans—well方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.

6、1的HELF細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1—Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞穿透人工重構(gòu)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1—Dicer質(zhì)粒的HELF細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。 結(jié)論：pcDNA3.1—Dicer質(zhì)粒體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚肺細(xì)胞HELF，可以有效地使Dicer基因在RNA水平和蛋白水平表達(dá)都增高，并且使HELF細(xì)胞MTT光吸收值顯著升高和穿透人工重構(gòu)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示Dicer基因高表達(dá)可以引起人胚肺細(xì)胞