化學(xué)計(jì)量學(xué)輔助GC-MS用于辛夷揮發(fā)油化學(xué)成分和抗炎作用機(jī)制研究.pdf

1、針對中藥復(fù)雜體系定性定量分析與藥效機(jī)制研究方面面臨的瓶頸問題，本課題以辛夷揮發(fā)油為研究對象，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析手段，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法及代謝組學(xué)研究技術(shù)，對辛夷揮發(fā)油的組成、藥代動力學(xué)、藥效學(xué)、作用機(jī)制等進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的研究，為揭示辛夷揮發(fā)油藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)，對于含有辛夷的中藥復(fù)方的藥效學(xué)研究亦具有一定的借鑒意義。
　　 具體研究內(nèi)容如下：
　　 1.氣相色譜中目標(biāo)色譜峰保留時(shí)間的預(yù)測
　　 先是

2、基于恒溫及一階程序升溫條件下目標(biāo)色譜峰的保留時(shí)間，對一階程序升溫條件下另一升溫速率的該目標(biāo)色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明，預(yù)測值和測量值的相對偏差較大；然后，在一階程序升溫條件下，用兩個不同升溫速率下目標(biāo)色譜峰的保留時(shí)間來預(yù)測另一速率下的保留時(shí)間，預(yù)測值與實(shí)測值較為接近，只有個別組分相對偏差大于1％，其它相對偏差較小。比之在恒溫下對目標(biāo)色譜峰保留時(shí)間的預(yù)測值來說，相對偏差明顯減小。
　　 基于實(shí)際需要，建立了可用于二階及多階程

3、序升溫的目標(biāo)色譜峰保留時(shí)間預(yù)測的方法。先以標(biāo)準(zhǔn)對照品為研究對象，預(yù)測正十六酸和二十九烷在二階程序升溫條件下的保留時(shí)間。結(jié)果顯示，預(yù)測值與實(shí)測值的相對偏差小于0.2％。然后以辛夷揮發(fā)油成分為考察目標(biāo)，相對偏差小于0.15％，預(yù)測結(jié)果滿意。并對一階和二階程序升溫條件下保留時(shí)間預(yù)測相對偏差進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，二階條件下的預(yù)測值和真實(shí)值更為接近。該預(yù)測方法可用來優(yōu)化氣相色譜條件，節(jié)省分析時(shí)間，提高分析效率，在實(shí)際工作中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

4、r>　　 2.化學(xué)計(jì)量學(xué)分辨技術(shù)和聯(lián)用色譜技術(shù)用于辛夷揮發(fā)油的復(fù)雜成分分析
　　 通過GC-MS聯(lián)用，結(jié)合直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法（HELP）對辛夷揮發(fā)油的成分進(jìn)行了定性和定量分析。以重疊色譜峰簇A和B為例，在解析過程中，先后使用FSMWEFA，ELPG和HELP方法，對重疊色譜峰進(jìn)行了解析。解析結(jié)果顯示：峰簇A是含有三組分的峰簇，峰簇A中的三個化合物分別為o-Cymene，D-Limonene和Eucalyptol，相對含量

5、分別為2.27％，4.52％，14.20％；峰簇B經(jīng)FSMWEFA法解析是4組分體系，但2D-ELPG顯示為3組分體系，為進(jìn)一步確定體系組分?jǐn)?shù)，采用3D-ELPG方法進(jìn)行確認(rèn)后，峰簇B包括四個化合物，解析結(jié)果和NIST數(shù)據(jù)庫比對后，確認(rèn)分別是Carotol，τ-Cadinol，τ-Muurolol和la-Cadin-4-en-10-ol，相對含量分別是0.13％，1.41％，1.01％，0.41％。采用此策略對辛夷揮發(fā)油進(jìn)行解析后，化合

6、物由原來直接由NIST檢索的65個增加至80個。
　　 在本研究中，我們充分利用了3D-ELPG的信息，解析結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠?？梢钥闯?，GC-MS聯(lián)用結(jié)合HELP方法可成功的用于分析辛夷揮發(fā)油成分，也充分說明化學(xué)計(jì)量學(xué)在分析復(fù)雜體系中具有潛在的優(yōu)勢，可提高組分定性和定量的準(zhǔn)確性。
　　 3.辛夷揮發(fā)油成分GC-MS指紋圖譜的建立
　　 通過多元曲線分辨一偏最小二乘法（MCR-ALS）對12批辛夷揮發(fā)油的重疊色譜峰

7、進(jìn)行了批量解析，增加了定性定量的準(zhǔn)確性；確定了12批樣品中辛夷揮發(fā)油的共有組分及含量，確定了辛夷揮發(fā)油中最主要的化合物，包括桉油精，異合金歡醇，α-水芹烯，莰烯，檸檬烯，α-杜松醇，α-芳樟醇，石竹烯，鄰聚傘花素等。采用n強(qiáng)峰、共有峰率及變異率對指紋圖譜進(jìn)行了評價(jià)，建立的方法穩(wěn)定、可靠，較為全面的反映了辛夷揮發(fā)油的化學(xué)成分，為辛夷藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.辛夷揮發(fā)油中主要活性成分1，8-桉葉素的藥代動力學(xué)初步研究

8、>　　 以1，8-桉葉素為研究對象，采用液-液萃取法提取血漿樣品，建立了以α-蒎烯為內(nèi)標(biāo)的氣相色譜法檢測血漿樣品中1，8-桉葉素濃度的方法。色譜分離條件為毛細(xì)管柱：SPBTM-1，0.25 mm×30 m×0.25μm；FID檢測器；載氣：氮?dú)猓魉?.0 mL/min；程序升溫條件：起始柱溫50℃，保持2 min，再以5℃/min的速率升溫至100℃，保持2 min。采用本文建立的生物樣品預(yù)處理方法和氣相色譜法測定樣品中1，8-桉葉

9、素的含量，生物樣品預(yù)處理方法回收率高，色譜分離選擇性好。本法的準(zhǔn)確度、精密度、專屬性和定量線性范圍均達(dá)到體內(nèi)藥物分析的要求。線性相關(guān)系數(shù)為0.999，日內(nèi)精密度范圍是3.75～5.74％，日間精密度范圍是2.41～5.58％。
　　 用上述建立的氣相色譜法測定血漿中1，8-桉葉素的濃度，根據(jù)所得的血藥濃度-時(shí)間曲線，采用非房室模型推算藥物動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，SD大鼠口服1，8-桉葉素后體內(nèi)血藥濃度消除較慢，個體差異較大。經(jīng)非房

10、室模型法估算的SD大鼠口服給藥后達(dá)峰時(shí)間為2h，達(dá)峰濃度為36.223μg/ml，藥時(shí)曲線末端相消除半衰期為4.811h，平均滯留時(shí)間為7.923h，AUC0～12和AUC0～∞別為227.09μg·h/ml，280.06μg`h/ml。
　　 5.辛夷揮發(fā)油抗炎作用的代謝組學(xué)初步研究
　　 首先建立角叉菜膠致大鼠急性炎癥模型，然后從藥效學(xué)角度證明辛夷揮發(fā)油具有較好的抗炎活性。然后采用GC-Ms分析正常組、模型組及給藥組

11、的三種不同狀態(tài)下大鼠的血漿代謝譜，采用NIST數(shù)據(jù)庫對不同組別大鼠血漿中的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行鑒定，使用多元模式識別方法分析大鼠不同組間的代謝物譜差異。在正常組和模型組的得分矩陣圖中，兩組的樣本點(diǎn)完全分離，說明致炎后大鼠正常生理代謝被干擾，從機(jī)體生理內(nèi)源性代謝物變化的層面可以認(rèn)為炎癥模型造模成功。在正常組、模型組及給藥組的得分矩陣圖中，三組的樣本點(diǎn)也達(dá)到了分離，而對照組和給藥組在第二主成分上毗鄰，這表明給藥組樣本有向?qū)φ战M移動的趨勢。

12、>　　 從三組的載荷矩陣圖中，可以得到對分類貢獻(xiàn)較大的生物標(biāo)記物。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，模型組中尿素、戊二胺、甘氨酸及乳酸的含量升高，且尿素和尸胺對分類貢獻(xiàn)最大，可認(rèn)為是角叉菜膠致炎對大鼠機(jī)體生理內(nèi)源性代謝產(chǎn)生擾動的生物標(biāo)記物。給藥組中尿素、戊二胺、甘氨酸及乳酸的含量下降，回到正常水平，而軟脂酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、膽固醇的含量升高，且高于正常組，可認(rèn)為是給藥后的生物標(biāo)記物。通過文獻(xiàn)調(diào)研表明，這些標(biāo)記物的改變和其抗炎活性存在一定