聯(lián)合應(yīng)用DNA免疫和細(xì)胞加強(qiáng)制備CD55單克隆抗體及抗體生物學(xué)活性分析.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河肈NA免疫和細(xì)胞加強(qiáng)方法制備抗人CD55分子單克隆抗體(Mab)，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，確定該方法制備抗體的可行性。 實(shí)驗(yàn)方法：RT-PCR方法克隆CD55分子編碼區(qū)全長基因，將擴(kuò)增基因定向?qū)胝婧吮磉_(dá)載體pcDNA3.1和原核表達(dá)載體pET28a中。誘導(dǎo)pET28a/55載體在大腸桿菌Rosseta中表達(dá)CD55，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。通過鹽酸胍變性溶解包涵體，并經(jīng)鎳柱純化得到重組CD55蛋白。重組質(zhì)粒

2、pcDNA3.1/55采用多次肌肉注射方法免疫小鼠，并在每次DNA免疫前對小鼠股四頭肌做預(yù)處理①DNA免疫前1周注射蛇毒心肌毒素；②DNA免疫前15分鐘注射25％的高滲蔗糖溶液。與細(xì)胞融合前3天，用高表達(dá)CD55分子HPB-ALL細(xì)胞加強(qiáng)免疫一次，之后采用傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備抗CD55分子單克隆抗體。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測每次免疫后小鼠血清中抗體分泌情況。應(yīng)用夾心ELISA方法檢測抗體的類型，并利用抗體競爭實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證制備抗體的表位

3、。通過流式細(xì)胞儀(FACS)、熒光顯微鏡驗(yàn)證抗體與天然細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合活性和特異性；Westernblot印證抗體與變性線性蛋白結(jié)合活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)擴(kuò)增CD55全長基因1174bp，構(gòu)建成pcDNA3.1/55重組質(zhì)粒。 (2)采用FACS檢測血清滴度，3次DNA免疫后其最高為1∶200，細(xì)胞加強(qiáng)后滴度最高為1∶800。 (3)通過細(xì)胞融合、篩選和克隆化培養(yǎng)最后得到兩株單克隆抗體分別為2B6E和

4、2B6B。 (4)兩株抗體IgG亞類均為IgG2a，輕鏈均為為κ型。 (5)抗體免疫競爭實(shí)驗(yàn)表明2B6B、2B6E、IA10(BD)和67(Serotec)之間識(shí)別不同的抗原表位。 (6)FACS、免疫熒光顯微鏡和Westernblot實(shí)驗(yàn)表明抗體與天然細(xì)胞膜蛋白和變性膜蛋白及重組蛋白都有良好的結(jié)合活性和特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：pcDNA3.1/55肌肉內(nèi)免疫后能激發(fā)小鼠產(chǎn)生針對CD55分子的抗體，聯(lián)合應(yīng)用細(xì)